郝亞琦，宗秀梅，任 潘，付愛根

(教育部西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室，陜西省生物技術(shù)與生化工程重點實驗室，西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 西安 710069)

光合作用是地球上生命的主要驅(qū)動力，將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能并釋放氧氣[1]。因此，光合作用對維持自然界的碳氧平衡以及能量轉(zhuǎn)化至關(guān)重要[2]。葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所，而光反應(yīng)的第一步就通過葉綠素吸收光能來完成[3]，綠色植物中的葉綠素改變會導(dǎo)致葉色發(fā)生變化[4]，從而影響到光合作用。目前，已有很多關(guān)于葉色的突變體研究，包含白化葉、黃色葉以及花斑葉等[5-8]。葉色變化可反映出葉綠體不同發(fā)育時期的狀況，有研究表明，在非生物脅迫下，過量表達(STAYGREEN-like)SGRL的擬南芥植物表現(xiàn)出早期的葉片發(fā)黃，而sgrl-1突變體表現(xiàn)出持久的葉片綠色，說明SGRL基因調(diào)節(jié)葉綠素的合成與降解[9]。此外，葉片發(fā)育影響植物生長，葉邊緣性狀會影響植物對于干旱、高溫等脅迫的適應(yīng)性以及植物的光合作用效率，并且葉片可以通過光線、溫度、微生物等各種環(huán)境信息整合內(nèi)部和外部信號來調(diào)控植物的生長發(fā)育[10]。因此，關(guān)于植物葉綠體發(fā)育以及葉片發(fā)育相關(guān)研究就尤為重要。

本研究所用的實驗材料是一株新生葉片葉心為黃色表型(黃心, yellow heart,yh)的擬南芥植株，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)該黃色葉片植株中依然有tlp18.3(Thylakoid Lumen Protein 18.3)突變體的T-DNA插入，這與tlp18.3突變體的表型不一致[11]，表明該黃色表型應(yīng)該是由于其他基因突變而導(dǎo)致。本研究通過圖位克隆以及測序分析，發(fā)現(xiàn)該突變體與已報道的ilityhla(ila)突變體為同一個等位基因，可為進一步研究yh基因調(diào)控植物葉綠體發(fā)育和葉片發(fā)育提供遺傳材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及種植條件

擬南芥Columbia(Col-0)和Lansbergerecta(Ler)生態(tài)型種子以及Col-0為背景的新生葉片黃心表型突變體種子均由本實驗室保存。將野生型與突變體種子在4 ℃ 春化3 d以確保發(fā)芽的一致性，隨后種植于溫室，培養(yǎng)條件為24 h連續(xù)光照，溫度23 ℃，光照強度60 μmol·m-2·s-1，相對濕度70%。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取取20～30 mg擬南芥葉片研磨，加入300 μL Edward 緩沖液，12 000 r/min離心5 min，將上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等量的異丙醇，混勻靜置10 min，離心去掉上清。再加入600 μL 70% 乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心5 min，去掉上清，重復(fù)該過程一次。沉淀放置晾干，加入50 μL滅菌ddH2O溶解DNA。

1.2.2 遺傳學(xué)分析與作圖群體構(gòu)建為了確定該突變表型的顯隱性，將該黃心突變體yh與擬南芥野生型Col-0進行雜交得到F1代，自交后得到F2代，通過統(tǒng)計F1和F2代出現(xiàn)的表型分離比，確定突變基因的遺傳規(guī)律。同時，將回交后的純合突變體與擬南芥Lansberg生態(tài)型進行雜交，挑取F2代具有突變表型(即黃心葉片表型)的植株用于構(gòu)建作圖群體。

1.2.3 圖位克隆通過擬南芥DNA粗提法提取F2代30個作圖群體植株葉片的混合基因組DNA，即DNA混合池。然后通過混合群體分析法(bulked segregant analysis, BSA)利用擬南芥5條染色體上的27個分子標(biāo)記為引物進行PCR鑒定，分析突變位點與染色體的分子標(biāo)記連鎖情況進行初定位，待確定突變位點所在的染色體后，擴大F2代作圖群體，選取F2代具有突變體黃心表型的植株分別提取基因組DNA，進一步篩選合適的分子標(biāo)記進行精細(xì)定位[12]，逐步縮小區(qū)間至676 kb的范圍內(nèi)甚至更小。本研究所使用的精細(xì)定位引物序列見表1。

1.2.4 測序及篩選候選基因?qū)⒓兒贤蛔凅w植株葉片組織進行全基因組測序(深圳華大基因股份有限公司)。通過分析單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)和插入缺失標(biāo)記(insertion-deletion, InDel)檢測結(jié)果，在TAIR(The Arabidopsis Information Resource)網(wǎng)站查詢INS1_55_342到INS1_56_34區(qū)間內(nèi)所有可能與葉綠體發(fā)育相關(guān)基因功能注釋，同時結(jié)合整合基因組瀏覽器(Integrative Genomics Viewer, IGV)軟件分析測序結(jié)果，通過與擬南芥野生型Col-0基因組序列比對，確定突變位點。為了驗證該突變基因是否為At1g64790的新等位基因，在該基因堿基缺失位點附近設(shè)計特異性引物(表2)進行擴增鑒定。

表1 精細(xì)定位所使用的分子標(biāo)記

表2 測序特異性引物

1.2.5 表型鑒定及葉綠素含量的檢測植物材料為生長3周左右的Col-0與yh突變體擬南芥葉片，同時進行3組技術(shù)重復(fù)以減少誤差。葉綠素提取方法：稱取3周左右的整株鮮重，分別加入1 mL丙酮、乙醇和蒸餾水(4.5∶4.5∶1)混合液(新鮮配置)，黑暗處理12 h以提取葉綠素。利用分光光度計在663 nm和645 nm處測量吸光度。使用以下公式計算葉綠素a(Ca)、b(Cb)及總?cè)~綠素(Ca+b)含量[13-14](mg/g)，其中，V單位為mL；M單位為g。

Ca= [(9.978OD663-0.99OD645)×V]/(M×1 000)

Cb= [(21.426OD663-4.65OD645)×V]/(M×1 000)

Ca+b=Ca+Cb

1.2.6 RNA的提取方法取50～100 mg擬南芥葉片于液氮中速凍，研磨成粉末狀后，加入1 mL Trizol-reagent震蕩混勻，于65 ℃ 水浴鍋放置5 min，室溫放置5 min，加入200 mL氯仿，渦旋30 s，室溫放置10 min。4 ℃、5 000 r/min離心10 min，吸上清于新的1.5 mL離心管，加入500 μL異丙醇上下顛倒混勻，室溫放置10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μL 75%乙醇，重復(fù)一次，將沉淀放置10～20 min晾至透明，加入50 μL 去RNA酶水，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的分離及表型分析

在篩選tlp18.3 T-DNA插入突變體時，分離到個別新生葉片的葉心為黃色的植株(圖1，A)，對其進行DNA水平的檢測之后，發(fā)現(xiàn)該植株與tlp18.3的突變體都具有T-DNA的插入，這與已報道的tlp18.3的突變體的綠色葉色不一致[11]，表明該黃心的表型不是由于tlp18.3 T-DNA插入引起的，可能存在其他的突變位點而導(dǎo)致。

2.2 突變體的基因定位與序列分析

2.2.1 突變體的遺傳學(xué)分析為了研究該基因的遺傳模式，將穩(wěn)定遺傳的純合黃心突變體與Col-0進行雜交，得到的F1代植株表型與Col-0相同，葉色均為綠色，而F1代自交得到F2代則出現(xiàn)綠色和黃心兩種表型，且分離比約為3∶1(綠色∶黃色=29∶10)，符合孟德爾遺傳定律，說明該突變體基因由隱性單基因控制。

2.2.2 突變位點的粗定位將分離掉tlp18.3 T-DNA插入的純合黃心突變體yh植株(圖1，B)與Lansberg生態(tài)型進行雜交，得到表型為綠色的F1代，F(xiàn)1代自交得到F2代，在F2代中挑選30株具有突變體黃心表型的植株混合提取DNA，即為Bulk混合池。根據(jù)擬南芥5條染色體上已知的27個分子標(biāo)記，通過PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，確定該突變位點位于第1條染色體上的第5個分子標(biāo)記INS1_56_34(24 095 072 bp)附近(圖2)。

2.2.3 突變位點的精細(xì)定位通過擴大作圖群體，共選取F2代254個具有突變體表型植株分別提取基因組DNA，利用INS1_52_626(22 073 177 bp)和INS1_63_98(26 628 510 bp)分子標(biāo)記通過PCR進行擴增鑒定。電泳結(jié)果顯示在INS1_52_626(22 073 177 bp)分子標(biāo)記處的重組率為19/225，在INS1_63_98(26 628 510 bp)分子標(biāo)記處的重組率為38/205，對19個重組個體用新的分子標(biāo)記(表1)INS1_55_342(23 418 760 bp)進行鑒定，其重組率為2/19，同時對38個重組個體再次用第1號染色體上的第5個分子標(biāo)記INS1_56_34(24 095 072 bp)進行PCR鑒定，重組率為2/38。最終將該突變區(qū)間縮小至INS1_55_342(23 418 760 bp)到INS1_56_34(24 095 072 bp)分子標(biāo)記之內(nèi)，物理距離約為676 kb(圖3)。

A. 生長4周的擬南芥Col-0，tlp18.3和yh的表型；B. tlp18.3 突變體T-DNA插入PCR鑒定；Bar = 1 cm圖1 突變體yh的表型及T-DNA插入鑒定A. Phenotypes of Col-0, tlp18.3 and yh plants grown for 4 weeks at greenhouse; B. Identification of T-DNA insertion site of tlp18.3 mutant. Bar = 1 cmFig.1 Phenotypes of yh mutant and T-DNA insertion site identification

電泳圖中的DNA模板從左到右依次為Col-0、Ler、Ler×yh F1和Bulk，虛線方框內(nèi)即代表突變位點所在染色體的分子標(biāo)記處圖2 混合群體分析法分析突變位點The DNA template in the electrophoretic pattern is Col-0, Ler, Ler×yh F1 and Bulk, the dotted box represents mutation siteFig.2 Analysis of mutation sites by bulked segregant analysis (BSA)

2.2.4 候選基因的篩選準(zhǔn)備≥100 mg的純合突變體葉片組織進行全基因組測序。通過分析突變體的SNP和InDel檢測結(jié)果，結(jié)合TAIR網(wǎng)站查詢INS1_55_342到INS1_63_98分子標(biāo)記區(qū)間內(nèi)的候選基因的功能注釋以及相關(guān)文獻報道，篩選出與該基因表型相關(guān)的候選基因。隨后，通過整合基因組瀏覽器(Integrative Genomics Viewer, IGV)軟件比對基因序列，發(fā)現(xiàn)該突變體在24 070 209 bp-24 070 212 bp處有4個堿基的缺失，通過PCR鑒定初步確定yh為At1g64790基因的突變體。

提取突變體基因組DNA，用基因特異的引物(表2)進行PCR擴增測序[生工生物工程(上海)股份有限公司]。結(jié)果如圖4，A所示，yh突變體顯示有4個堿基的缺失。

2.3 葉綠素含量的檢測

在擬南芥中，白色或黃色的葉片通常與葉綠素缺乏有關(guān)[15]。由于該突變體營養(yǎng)生長期呈現(xiàn)黃心表型，推測為葉綠素缺乏，對生長3周左右的擬南芥Col-0和突變體yh的葉綠素含量進行了檢測可知，突變體yh的葉綠素含量明顯低于野生型Col-0(圖4，B)，說明該突變體的黃色葉片確實與葉綠素的缺乏有關(guān)。另外，對生長3周的突變體進行RNA水平的檢測，發(fā)現(xiàn)突變體yh的RNA含量略低，且條帶大小比野生型小，表明突變體中有堿基的缺失。為了進一步確定其缺失的位點，將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體中，測序之后表明突變體中發(fā)生了剪接位點的變化，最終導(dǎo)致缺失了66 bp的外顯子區(qū)域，進而對其氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)突變體yh中缺失了22個氨基酸(圖4，C-F)，而造成突變體葉綠素發(fā)育受到影響。結(jié)合前人的研究結(jié)果，該yh突變體是At1g64790基因的一個新等位突變，在營養(yǎng)生長期的黃心表型是由于該基因的部分功能缺失造成的，前人研究表明At1g64790在葉邊緣處顯示了鋸齒狀表型，也暗示了yh基因在葉生長發(fā)育中的重要作用。

3 討 論

前期從T-DNA插入的突變體中分離得到了一個黃心突變體yh，通過圖位克隆和全基因組測序，鑒定得到一個以Col-0為背景的與葉綠素發(fā)育相關(guān)的黃心突變體yh，該突變體在內(nèi)含子區(qū)域缺失了4個堿基，導(dǎo)致外顯子缺失了66個堿基，這與真核生物基因在轉(zhuǎn)錄過程中識別內(nèi)含子的兩端堿基GT和AT有關(guān)[16]，突變體中的第44個內(nèi)含子的左端GT中的T缺失，導(dǎo)致了原本的GT剪切位點消失而進行了錯誤剪切而產(chǎn)生突變性狀。

A. 突變位點所在染色體位置及精細(xì)定位示意圖?；旌先后w分析結(jié)果表明yh突變體位于第1號染色體的INS1_52_626和INS1_63_98分子標(biāo)記之間。第一個紅星代表突變位點所在染色體位置，第二個紅星代表突變位點所在分子標(biāo)記處；B. At1g64790基因結(jié)構(gòu)及缺失堿基所在部位示意圖，黑色方框代表外顯子，橫線代表內(nèi)含子；C. 紅色字母代表yh突變體全基因組測序結(jié)果中顯示的缺失堿基圖3 yh突變體的精細(xì)定位示意圖A. Schematic diagram of the chromosome location and fine mapping of the mutation site. Bulk segregation analysis showed that yh mutant was localized on chromosome 1, between markers INS1_52_626 and INS1_63_98. The red stars represent the mutation site and molecular marker site respectively; B. Schematic diagram of At1g64790 gene structure and mutation site, the black box represent exons and the solid lines indicate introns; C. The red letters represent deletion bases in yh mutantFig.3 Fine mapping of yh mutant locus

A. 擬南芥野生型Col-0和yh的測序結(jié)果，黑色方框內(nèi)為yh突變體缺失的4個堿基；B. 擬南芥野生型Col-0和yh突變體的葉綠素含量，星號*代表顯著性差異，n=5，P<0.05；C. At1g64790 mRNA水平鑒定所用的引物示意圖；D. 擬南芥突變體yh RNA水平鑒定；E. 突變體yh mRNA測序結(jié)果。黃色大寫字母代表外顯子，紫色小寫字母代表內(nèi)含子，內(nèi)含子上4個堿基的缺失導(dǎo)致剪切位點的改變，測序結(jié)果顯示在突變體中的第44和45位區(qū)域外顯子缺失了66 bp；F. 擬南芥野生型Col-0和yh的氨基酸序列比對結(jié)果圖4 突變體yh特性分析A. Sequencing results of Col-0 and yh mutant, the black box shows the 4 bases missing in yh mutant; B. Chlorophyll content of Col-0 and yh mutant leaves, the asterisk * represents a significant difference, (P<0.05); C. Schematic diagram of primers used for At1g64790 RNA level identification; D. mRNA level of Col-0 and yh mutant; E. Results of RNA sequencing of mutant yh. Yellow capital letters represent exons, and purple lowercase letters represent introns. 4-bases deletion in mutant results in the alteration splicing of the intron. Sequencing analysis revealed a 66 bp deletion in the 44 and 45 exon of the yh mutant; F. Amino acid sequence alignment results of Col-0 and yh mutantFig.4 Characteristics analysis of yh mutant

在營養(yǎng)生長期，突變體yh真葉中的葉綠素含量較野生型低(圖4，B)，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)yh突變體與已報道的ila突變體為同一個基因At1g64790的弱突變體，都具有相似的黃心表型，但兩者的突變機制不同。ILA編碼一個分子量為296.56 kD的蛋白，含有HEAT REPEAT序列，并且與植物免疫相關(guān)[15-17]。ila突變體的表型除了形狀異常的黃色葉片和雄性不育之外，也對致病細(xì)菌P.syringaeDC3000的易感性增加，表明ILA在抵抗P.syringae的防御中也發(fā)揮作用[15]。同時，F(xiàn)aus等[18]通過對葉綠素含量、光合參數(shù)等分析發(fā)現(xiàn)，突變體在生長前期葉綠體發(fā)育異常，但隨著植物進一步發(fā)育，葉綠體發(fā)育缺陷逐漸恢復(fù)正常水平。綜上，ila基因的功能不僅涉及調(diào)控植物抗逆，同時與葉綠體發(fā)育相關(guān)，該基因的突變會導(dǎo)致植物出現(xiàn)多效性的表型，其功能還與葉片發(fā)育、花粉育性、葉綠素生物合成和細(xì)菌防御信號以及根的發(fā)育等等[15,18]。值得一提的是，雖然本研究所得到的yh突變體表型與ila弱突變體的表型相近，均為黃色葉心，但兩者的葉邊緣形狀略有不同，ila的弱突變體葉片邊緣顯示為鋸齒狀，顯示出葉緣缺刻明顯等生長缺陷特征[15]，而本研究所得到的yh突變體葉片邊緣光滑，無鋸齒狀，說明該突變體yh與已報道的突變體有所不同，屬于不同的等位基因株系，這也從另一方面說明了該基因有可能在擬南芥葉片葉邊緣的形態(tài)發(fā)生過程中發(fā)揮一定的作用，關(guān)于該基因是否參與到葉片形態(tài)發(fā)生這一過程將是下一步研究的重點。