楊麗麗， 楊平飛， 韓 雪， 劉 筱， 黃蘇豫，2， 劉佳微，2， 吳明開*

(1.貴州省現(xiàn)代中藥材研究所/貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州大學(xué)， 貴州 貴陽 550025)

白及為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.]的干燥塊莖，是《中國藥典》收載的常用中藥之一，廣泛用于治療吐血、咳血、肺結(jié)核吐血、外傷出血、潰瘍病出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥，療效顯著[1]。白及主要含有聯(lián)芐類、聯(lián)菲類、二氫菲類、苷類及白及多糖等多種化合物[2]。目前，對白及的研究主要涉及種植加工、成分提取分離與性質(zhì)研究、抗氧化活性、藥理活性以及藥理作用和臨床應(yīng)用等[3]，對白及多糖的研究也較多，但缺乏有效的提取分離方法，致使其組分、結(jié)構(gòu)和生物活性研究不深入。雌雄動(dòng)物在生理學(xué)上的特異性常常導(dǎo)致對藥物的反應(yīng)也存在差異，到目前為止，對白及止血作用的活性部位、對雌雄動(dòng)物的作用差異及其作用機(jī)制缺乏系統(tǒng)的比較。為此，筆者對白及進(jìn)行提取并研究乙酸乙酯部位、乙醇部位、水提部位對雌雄小鼠的止血作用，在此基礎(chǔ)上探討其發(fā)揮止血作用的機(jī)制，為白及的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級昆明小鼠，體質(zhì)量20～22 g，均購自長沙天勤生物科技有限公司，許可證號(hào):scxk(湘)2014-0010。小鼠自由攝食、飲水，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 藥物 白及為安龍縣欣蔓生物科技有限責(zé)任公司白及基地采收的干燥塊莖，原植物經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thund.) Reichb.F.]。

1.1.3 試劑 云南白藥，云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào):ZMA141520141210；羧甲基纖維素鈉，生工生物工程(上海)有限公司，批號(hào):F531BA0017；肝素鈉注射液，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):5789001；水合氯醛，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20190012；凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物，批號(hào):20190818，購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；纖溶酶原激活物抑制劑-1，批號(hào):20191124，購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；乙醇為分析純。

1.1.4 儀器 Centrifuge 5418R臺(tái)式離心機(jī)，德國eppendorf；DK-98-ⅡA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；SAF-680T酶標(biāo)儀，美國寶生物科技有限公司；Hei-VAP Value旋蒸儀，德國海道爾夫Heidolph有限公司；Milli-Q Reference超純水機(jī)，美國Millipore有限公司；METTLER AE240十萬分之一電子天平，梅特勒-脫利多儀器上海有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 準(zhǔn)確稱取白及干燥塊莖粉碎1 000 g，75%乙醇回流提取6次，回流2 h/次，提取液減壓濃縮至無醇味，水浴上蒸干，得白及醇提浸膏。取適量醇提浸膏用蒸餾水混懸后乙酸乙酯萃取至色淡。萃取液及萃取后的水層部分減壓濃縮至固體，真空干燥獲得乙酸乙酯提取物、乙醇提取物及水層部分，置于干燥器中避光保存待測[4]。

1.2.2 陽性對照藥干預(yù) SPF級昆明小鼠按云南白藥人臨床用量(2 g/人)的20倍灌胃給藥，即0.667 g/kg。稱取云南白藥粉末6.67 g，加入0.5%羧甲基纖維素鈉100 mL研磨均勻即得給藥劑量。

1.2.3 白及提取物干預(yù) SPF級昆明小鼠按白及人臨床用量(15 g/人)的20倍劑量灌胃給藥，即為5 g/kg。稱取白及醇提浸膏50 g加入0.5%羧甲基纖維素鈉100 mL研磨均勻，灌胃量6.8 g/kg。

1.2.4 全身肝素化小鼠

1)出血時(shí)間(BT)測定。取昆明小鼠60只(雌雄各半)，隨機(jī)平分為6組，即空白對照組、肝素化模型組、云南白藥組、白及乙醇提取物組、白及乙酸乙酯提取物組、白及水提取物組?？瞻捉M和肝素化模型組分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉生理鹽水20 mL/kg，其余組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥物和提取物組，給藥1次/d，連續(xù)5 d，第5天灌胃給藥60 min后，除空白組外，其余各組均尾靜脈注射肝素鈉3.2 U/只，15 min后用手術(shù)刀于距小鼠尾尖0.5 cm處割斷，待血液自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔30 s用濾紙吸附血滴1次，直至濾紙吸附無血跡。人工形成創(chuàng)面到出血停止所經(jīng)時(shí)間為小鼠出血時(shí)間(BT)。

2)小鼠凝血時(shí)間(CT)測定。利用出血時(shí)間測定組的昆明小鼠，第5天給藥60 min后，除空白組外，其余各組均尾靜脈注射肝素鈉3.2 U/只，15 min后用內(nèi)徑1 mm、長10 cm的毛細(xì)玻璃管從小鼠內(nèi)眼球后靜脈叢取血，待血液充滿玻璃管時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔30 s折斷兩端毛細(xì)玻璃管(約0.5 cm)，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處有無血凝絲出現(xiàn)。血液充滿玻璃管開始至出現(xiàn)血凝絲所經(jīng)時(shí)間為小鼠凝血時(shí)間(CT)。

3)血小板聚集率測定。按照測定出血時(shí)間的方法，連續(xù)灌胃給藥6 d，第7天灌胃給藥60 min后，腹腔注射水合氯醛100 g/L麻醉，用3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管腹主動(dòng)脈釆集血樣，800 r/min離心10 min，分離上層血漿即得富血小板血漿(PRP)，余下部分3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿即得貧血小板血漿(PPP)，用PPP調(diào)PRP中血小板的計(jì)數(shù)為3×1011個(gè)/L，用PPP調(diào)零后，取PRP 290 μL，37℃孵育60 s后，加入終濃度為 5 μmol ADP 10 μL，記錄5 min內(nèi)血小板的最大聚集率。

4)凝血因子測定。昆明小鼠分組及給藥方法同血小板聚集率測定。取枸櫞酸抗凝全血，3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿備用。按試劑盒要求測定凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TAT)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用Mean±SEM表示。經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVA)后，采用Turkey’s test分析方法比較組間差異，兩組間比較采用t-test法。

2 結(jié)果與分析

2.1 白及不同極性提取部位干預(yù)雌雄小鼠的出血時(shí)間

小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后，出血時(shí)間與空白組相比顯著延長(P<0.005)，說明小鼠出血模型建模成功。與模型組相比，雄性、雌性小鼠云南白藥干預(yù)組均能顯著縮短全身肝素化小鼠的出血時(shí)間(P<0.005)，白及乙醇提取物、水提取物干預(yù)后的雌雄小鼠均顯著表現(xiàn)出與模型組更少的出血時(shí)間(P<0.005，P<0.01)；乙酸乙酯提取物干預(yù)雌鼠的出血時(shí)間與模型組無顯著差異(P>0.05)，干預(yù)雄鼠的出血時(shí)間顯著高于模型組(P<0.05)(圖1A、圖1C)。將雌雄小鼠的檢測結(jié)果組合進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，云南白藥、白及乙醇提取物、水提取物干預(yù)均能明顯縮短全身肝素化小鼠的出血時(shí)間(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干預(yù)的出血時(shí)間無顯著變化(P>0.05)(圖1B)；云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預(yù)對全身肝素化雌雄小鼠出血時(shí)間的縮短率分別為74.36%、48.96%和31.24%(圖1D)。

注：Con為對照組，Mod為模型組，YNBY為云南白藥干預(yù)組，H2O為白及水提取部位干預(yù)組，EtOAc為白及乙酸乙酯提取部位干預(yù)組，EtOH為白及乙醇提取部位干預(yù)組。***表示與對照組比P<0.005；#表示與模型組比P<0.05，##表示P<0.01，###表示P< 0.005。下同。圖1 不同組雌雄小鼠的出血時(shí)間(n=10)

2.2 白及不同極性提取部位干預(yù)雌雄小鼠的凝血時(shí)間

小鼠尾靜脈注射肝素鈉注射液后，凝血時(shí)間與空白組相比顯著延長(P<0.005)，與模型組相比，雄性、雌性小鼠云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預(yù)均能顯著縮短凝血時(shí)間(P<0.005，P<0.01)，乙酸乙酯提取物干預(yù)雌鼠的凝血時(shí)間與模型組無顯著差異(P>0.05)，乙酸乙酯提取物干預(yù)雄鼠的凝血時(shí)間顯著高于模型組(P<0.05)(圖2A、圖2C)。將雌雄小鼠的檢測結(jié)果組合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，云南白藥、白及乙醇提取物、水提取物干預(yù)均能顯著縮短小鼠的凝血時(shí)間(P<0.005)，乙酸乙酯提取物干預(yù)的出血時(shí)間無顯著影響(P>0.05)(圖2B)；云南白藥、白及乙醇提取物、白及水提取物干預(yù)雌雄小鼠凝血時(shí)間的縮短率分別為82.16%、76.44%和34.26%(圖2D)。

圖2 不同組雌雄小鼠的凝血時(shí)間(n=10)

2.3 白及不同極性提取部位干預(yù)雌雄小鼠血小板的凝集率

云南白藥、白及水提取部分、白及乙醇提取部分干預(yù)均能顯著提高雄性小鼠的血小板凝集率(P<0.05，P<0.01，P<0.005)，乙酸乙酯提取物的血小板凝集率無顯著變化(P>0.05)(圖3A)。將雌雄小鼠的檢測結(jié)果組合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，云南白藥、白及水提取物、乙醇提取物干預(yù)分別提高小鼠血小板的凝集率25.22%、16.36%和11.32%(圖3B)。

注：*表示與對照組比P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.005。下同。圖3 不同組雌雄小鼠血小板的凝集率(n=10)

2.4 白及不同極性提取部位干預(yù)雌雄小鼠凝血因子的含量

云南白藥、白及水提取物干預(yù)均能顯著提高雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1含量(P<0.01，P<0.05)，乙醇提取物對雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1含量無顯著影響(P>0.05)；乙酸乙酯提取物干預(yù)減少小鼠血漿中TAT含量，對PAI-1含量無顯著作用(圖4A、圖4C)。將雌雄小鼠的檢測結(jié)果組合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，云南白藥、白及水提取物干預(yù)分別提高小鼠血漿中TAT含量20.36%和11.32%，PAI-1含量分別提高18.89%和9.12%(圖4B、圖4D)。

圖4 不同組雌雄小鼠血漿中TAT和PAI-1的含量(n=10)

3 結(jié)論與討論

白及的組成成分復(fù)雜，許多功能成分還沒有被發(fā)現(xiàn)、分離和利用。隨著一些新的活性物質(zhì)被不斷發(fā)現(xiàn)和分離，其生物活性、藥理活性及其作用機(jī)制需要闡明。董莉等[5]研究表明，白及塊莖水提物或極性溶劑醇提取物對大鼠實(shí)質(zhì)性器官如肝、脾、肌肉血管出血的止血和凝血效果良好。白及水提物中多為大極性分子，其中包括大量的多糖成分[6]。有研究表明，白及膠多糖發(fā)揮止血功能可能是激活了大鼠內(nèi)源性和外源性凝血系統(tǒng)，促進(jìn)血小板聚集而達(dá)到止血作用[7-10]。白及止血作用的主要有效成分是水溶性部分和醇溶性部分，能顯著提高血小板最大凝集率，促進(jìn)血小板凝集。白及非多糖組分BS-80EE具有促進(jìn)ADP誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)血小板的聚集作用，縮短全身肝素化小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，作用效果呈劑量關(guān)系[6]。原因可能是白及能使血細(xì)胞凝集，血小板活化、形變，聚集，還能縮短凝血酶生成時(shí)間而發(fā)揮止血作用。

研究結(jié)果表明，白及醇提物、水提物對雌雄小鼠均具有止血作用，其中白及水提物止血作用最顯著，乙酸乙酯提取物對雄性小鼠具有延長凝血、出血時(shí)間的作用，但對雌性昆明小鼠未造成明顯影響，可能是激素與凝血調(diào)節(jié)相關(guān)酶能夠相互作用，導(dǎo)致藥物在雌雄昆明小鼠中的止血作用效果存在差異；白及水提物能夠顯著促進(jìn)血小板凝集作用，并明顯增加纖溶酶原激活物抑制劑-1含量。白及3種提取物的止血作用，以白及水提取物的止血效果最優(yōu)，表明其具有良好的止血功效，可通過促進(jìn)血小板聚集和凝血而發(fā)揮止血作用。