張潤(rùn)祥，陳艷青，楊凱淇，于翰林，王曉萱，魏海東，李純，李劍虹，包軍*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

鈣是動(dòng)物體必需營(yíng)養(yǎng)成分，影響蛋殼形成和骨骼健康。蛋雞對(duì)鈣元素有較高代謝需求，缺鈣導(dǎo)致骨質(zhì)流失，易引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。龍骨損傷是危害蛋雞生產(chǎn)福利問(wèn)題之一。研究鈣營(yíng)養(yǎng)水平與蛋雞龍骨損傷關(guān)系及對(duì)龍骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響，將為降低龍骨損傷發(fā)生率提供鈣營(yíng)養(yǎng)思路。

鈣主要以磷酸鈣方式儲(chǔ)存在骨骼中，并以碳酸鈣形式儲(chǔ)存于蛋殼中[1]。我國(guó)蛋雞攝入100 g飼料鈣推薦量為3.5%[2]。骨骼是一種受生理、營(yíng)養(yǎng)和物理因素如機(jī)械應(yīng)力和身體活動(dòng)影響的動(dòng)態(tài)生物組織，含有大量骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞不斷重塑和修復(fù)維持骨骼健康[3]。由于產(chǎn)蛋行為特殊需求，蛋雞具有獨(dú)特骨代謝和生理過(guò)程[4]。在產(chǎn)蛋期開(kāi)始時(shí)，蛋雞停止正常的骨骼生長(zhǎng)并發(fā)育成髓質(zhì)骨[5]。隨產(chǎn)蛋持續(xù)進(jìn)行，骨強(qiáng)度降低和骨脆性增加，蛋雞易發(fā)生骨折[6]。家禽龍骨是一種從胸骨延伸并軸向越過(guò)中線的結(jié)構(gòu)骨，在禽類骨骼中具有特殊地位，在禽類飛行和呼吸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。龍骨損傷包括龍骨骨折和龍骨彎曲，龍骨骨折可能與蛋雞對(duì)產(chǎn)蛋行為適應(yīng)性與突然碰撞等行為學(xué)事件發(fā)生有關(guān)，也與籠舍設(shè)施資源、鈣磷營(yíng)養(yǎng)代謝水平及遺傳品種相關(guān)，龍骨骨折主要發(fā)生產(chǎn)蛋開(kāi)始至45周齡階段[7-8]。龍骨損傷不僅改變蛋雞行為表現(xiàn)，降低生產(chǎn)性能和雞蛋質(zhì)量，還影響蛋雞情緒和生理狀況，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失[7-9]。因此，龍骨損傷特別是龍骨骨折已成為商業(yè)蛋雞的生產(chǎn)和福利問(wèn)題。因此，本文聚焦鈣營(yíng)養(yǎng)，探討低鈣日糧對(duì)蛋雞龍骨損傷發(fā)生率、龍骨微觀結(jié)構(gòu)和離子濃度的影響。

微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（Micro-CT）已被廣泛用于評(píng)估動(dòng)物骨骼微結(jié)構(gòu)[10]。評(píng)估骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁分離度（Tb.Sp），骨小梁數(shù)量（Tb.N）和連接密度（Conn.D.）[11]。研究結(jié)果表明，蛋雞龍骨骨折改變龍骨骨骼質(zhì)量，導(dǎo)致骨體積分?jǐn)?shù)、小梁數(shù)、各向異性度（DA）和連接密度減少及小梁分離增加[12]。骨質(zhì)疏松還導(dǎo)致雞股骨質(zhì)量下降和小梁顯微結(jié)構(gòu)改變[13]。

飼糧低鈣水平影響蛋雞骨骼健康，為了解飼糧低鈣水平與蛋雞龍骨損傷之間關(guān)系及低鈣日糧對(duì)蛋雞龍骨骨骼微觀參數(shù)和離子濃度的影響，本研究對(duì)產(chǎn)蛋初期蛋雞持續(xù)飼喂低鈣日糧17周，測(cè)定蛋雞龍骨骨折發(fā)生率、骨礦物密度（BMD）、結(jié)構(gòu)參數(shù)和元素濃度，揭示低鈣日糧對(duì)蛋雞龍骨參數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和飼養(yǎng)方案

本試驗(yàn)購(gòu)買20周齡（wk）健康羅曼白蛋雞180只（購(gòu)自黑龍江先鋒民勝種雞場(chǎng)），隨機(jī)分為對(duì)照組（Con）組和低鈣飲食（LCa）組，每組6個(gè)籠子，每籠15只。將蛋雞飼養(yǎng)于富集籠（長(zhǎng)×寬×高為180 cm×70 cm×70 cm，含有方型木制棲架、草坪墊）和紅色半封閉產(chǎn)蛋箱，每籠配置乳頭飲水器。雞舍為半封閉飼舍，蛋雞自由進(jìn)食和飲水。試驗(yàn)期間（20~37 wk），雞舍溫度和濕度分別控制在22~26℃和45%~65%。雞舍機(jī)械通風(fēng)并配合自然通風(fēng)，采用自然光和人工光照結(jié)合方式，光照周期為16L∶8D。日糧營(yíng)養(yǎng)水平中，對(duì)照組有效鈣水平為3.37%，低鈣組有效鈣水平為1.5%。飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示。

表1 蛋雞飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Dietary composition and nutrient levels of laying hens

1.2 龍骨損傷評(píng)估

龍骨損傷判定依據(jù)Scholz等[14]和Richard等[15]介紹的活雞觸診方法，為減小觸診誤差，龍骨損傷觸診判定均由1人完成。觸診時(shí)，1只手從翅根處固定翅膀，抓起雞暴露腹部，另1只手食指和拇指沿龍骨腹外側(cè)邊緣觸摸，判斷龍骨是否發(fā)生損傷。根據(jù)龍骨是否存在彎曲和骨折，將龍骨狀態(tài)分為3類：正常龍骨（NK）、彎曲龍骨（DK）和骨折龍骨（FK）。正常龍骨從龍骨矢狀面尖端到尾部呈180°直線或從龍骨尖端到尾部偏離矢狀面范圍<0.5 cm；彎曲龍骨是指偏離范圍>0.5 cm，且龍骨表面光滑，無(wú)任何明顯位移或骨膜疤痕，也無(wú)凸起或腫脹。骨折龍骨指龍骨表面有明顯凸起，傷疤、腫脹、斷裂、位移或胼胝形成。彎曲和骨折同時(shí)存在判定為龍骨骨折，因?yàn)楣钦弁春蛡h(yuǎn)超過(guò)彎曲。在第25、29、33和37周，評(píng)估所有蛋雞龍骨損傷狀況。根據(jù)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觸診結(jié)果計(jì)算龍骨損傷發(fā)生率，最后1次龍骨損傷以解剖后視診為準(zhǔn)。

1.3 樣品采集

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估蛋雞龍骨狀態(tài)，記錄龍骨損傷發(fā)生率。最后1次觸診后剖殺雞只，將龍骨切除，肌肉和其他與龍骨連接軟組織完全移除，采集龍骨樣品，儲(chǔ)存于-80℃冰箱進(jìn)一步分析。

1.4 顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描分析

將對(duì)照組和低鈣組蛋雞龍骨樣品（每組n=6）尾端分別切割1.3 cm，浸泡在4%多聚甲醛溶液中用于顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描分析（Micro-CT，CT 50斯堪科醫(yī)療股份有限公司，瑞士蘇黎世）。檢測(cè)條件中體素尺寸16 m，源電位70 kV，電流200 A，積分時(shí)間300 ms，鋁濾波器0.5 mm。每次掃描均使用Mimics 19.0重構(gòu)。骨分析（ABA）軟件確定骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)：骨礦物質(zhì)密度（BMD）、骨表面積和組織體積比值（BV/TV）、骨骼表面（BS）、骨表面和骨組織比值（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、各向異性的程度（DA）和連接密度（Conn.D.）。

1.5 龍骨礦物質(zhì)元素濃度測(cè)定

從對(duì)照組和低鈣組蛋雞龍骨樣品中，選擇距尾緣2 cm處切割1.0 g樣品，于液氮中研磨成粉末狀，微波消解儀消解，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，Thermo iCAP Q，MA，USA）測(cè)定元素濃度。29種骨礦物質(zhì)元素，包括鋰（Li）、硼（B）、鈉（Na）、鎂（Mg）、鋁（Al）、硅（Si）、磷（P）、鉀（K）、鈣（Ca）、鈦（Ti）、釩（V）、鉻（Cr）、錳（Mn）、鐵（Fe）、鈷（Co）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鋅（Zn）、砷（As）、硒（Se）、鍶（Sr）、鉬（Mo）、鎘（Cd）、錫（Sn）、銻（Sb）、鋇（Ba）、汞（Hg）、鉈（Tl）和鉛（Pb）。將每個(gè)龍骨樣品在含有5 mL 65%（W/W）HNO3和2 mL 30%H2O2（W/V）溶液中消解，然后用去離子水稀釋至10 mL。隨后在功率為1 800 W微波消解系統(tǒng)中再次消解樣品：100℃3 min，150℃10 min和180℃45 min。待樣本冷卻至室溫后，所有消解樣品均用超純水稀釋至50 mL，充分混合后用ICP-MS分析。ICP-MS操作參數(shù)如下：頻率27.12 MHz，反射功率1 550 W，載氣流量1.05 L·min-1，等離子氣體流量14.0 L·min-1，輔助氣體流量0.8 L·min-1，S/C溫度為2.7℃，采樣深度為6.0 mm，霧化器泵40 r·min-1，氧化物離子（156/140）<2.0%，雙電荷（70/140）<3.0%。所有礦物質(zhì)元素含量均采用空白和標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 22（SPSS Inc.Chicago，IL，USA）分析所有數(shù)據(jù)。使用Kolmogorov-Smirnov法對(duì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)、礦物密度及元素濃度數(shù)據(jù)檢驗(yàn)正態(tài)分布，均符合正態(tài)分布。使用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較從對(duì)照組和低鈣組獲得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)差異，當(dāng)P<0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍骨損傷

圖1 顯示蛋雞在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)龍骨損傷評(píng)估結(jié)果。在25、29、33和37周齡時(shí)，低鈣組蛋雞龍骨損傷（包括龍骨彎曲和龍骨骨折）發(fā)生率高于對(duì)照組。自25~37周齡，對(duì)照組蛋雞正常龍骨比例分別為60.00%、50.00%、47.38%、38.89%；龍骨彎曲比例為25.00%、21.43%、26.31%、23.33%；龍骨骨折比例為15.00%、28.57%、26.31%、27.78%。低鈣組蛋雞正常龍骨比例分別為25.00%、18.75%、15.38%、12.50%；龍骨彎曲組比例為43.75%、31.25%、30.77%、31.25%；龍骨骨折組比例為31.75%、50.00%、53.85%和56.25%。與對(duì)照組相比，低鈣組蛋雞龍骨損傷率明顯增高且隨產(chǎn)蛋雞年齡增加，龍骨損傷發(fā)生率逐漸增加。

圖1 對(duì)照組和低鈣飲食組蛋雞龍骨損傷率Fig.1 Keel damage rate of laying hens in control group(Con)and LCa group

2.2 龍骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)和骨密度

蛋雞龍骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)和骨密度見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，低鈣組蛋雞TV、BV、BV/TV、Conn.D.、Tb.Th、Tb.Sp、BS、BS/BV、DA、BMD差異顯著（P<0.05），其中TV、Conn.D.、Tb.Sp、BS、BS/BV、BMD值降低，BV、BV/TV、Tb.Th、DA值增加。

表2 對(duì)照組和低鈣飲食組蛋雞龍骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)和骨密度Table 2 Bone microstructure parameters and BMD of laying hens in control group(Con)and(LCa)diet group

續(xù)表

2.3 龍骨礦物質(zhì)元素含量

蛋雞龍骨中礦物質(zhì)元素含量見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，低鈣組蛋雞鉀、鐵、銅、鍶、鉬、錳、鋅、釩、硒、鉈、鉛含量增加（P<0.05），而鈣、鎳、鋰、汞含量下降（P<0.05）。對(duì)照組和低鈣組蛋雞龍骨中其他元素含量差異不顯著（P>0.05）。

表3 對(duì)照組和低鈣飲食組蛋雞龍骨礦物質(zhì)元素濃度Table 3 Element concentrations of laying hens in control(Con)and low-calcium diet(LCa)groups

3 討論

日糧鈣水平對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和骨骼質(zhì)量起重要作用。骨質(zhì)疏松癥是蛋雞骨骼問(wèn)題主要原因之一，特別在產(chǎn)蛋高峰期，通常是由于日糧中鈣缺乏引起。低鈣飼糧飼喂蛋雞，股骨和脛骨骨密度明顯減小，說(shuō)明低鈣飲食加重骨質(zhì)疏松，改變骨結(jié)構(gòu)[16]。隨蛋雞產(chǎn)蛋周齡增加，骨骼中鈣含量減少導(dǎo)致骨骼脆性增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。研究發(fā)現(xiàn)，37周齡蛋雞龍骨損傷特別是龍骨骨折發(fā)生率顯著高于25周齡，表明龍骨骨折發(fā)生率隨蛋雞年齡增加而上升，且集中發(fā)生在產(chǎn)蛋初期至產(chǎn)蛋高峰期，50周齡后增長(zhǎng)速度變緩[18]。飼喂含1.5%低鈣日糧蛋雞龍骨偏離和骨折發(fā)生率明顯增高，表明添加1.5%有效鈣日糧對(duì)籠養(yǎng)蛋雞龍骨生長(zhǎng)和健康有負(fù)面影響，可能與低鈣日糧致蛋雞骨骼密度降低，結(jié)構(gòu)變化和骨骼元素穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。

Micro-CT作為骨健康評(píng)估工具，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、DA等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)參數(shù)可準(zhǔn)確評(píng)估骨骼狀態(tài)，反映骨骼質(zhì)量。高數(shù)值BV/TV、Tb.Th、Tb.N及低數(shù)值Conn.D.和BS/BV與骨機(jī)械應(yīng)變相關(guān)，Tb.Th與骨強(qiáng)度呈正相關(guān)[19]。此外，骨密度已成為骨折風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，可精確指示骨量變化，較低骨密度與較高骨損傷直接相關(guān)[20]。與對(duì)照組相比，低鈣組蛋雞龍骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)TV、Conn.D.、Tb.Sp、BS、BS/BV、BMD較低，而B(niǎo)V、BV/TV、Tb.Th、DA較高。在骨質(zhì)疏松早期，DA值通常增加，BV、BV/TV值增加表示骨代謝水平升高，說(shuō)明低鈣日糧可誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥。據(jù)報(bào)道，飼喂常規(guī)鈣添加劑量日糧（3.7%）和高鈣日糧（4.4%）蛋雞比飼喂低鈣日糧（2.62%）蛋雞具有較強(qiáng)骨強(qiáng)度和更大骨密度[21]。

低鈣（1.5%）飲食導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度降低，同時(shí)引起蛋產(chǎn)量和蛋質(zhì)量降低[16]，低鈣飼糧誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松常表現(xiàn)為骨量、寬度和強(qiáng)度大幅降低，骨小梁微結(jié)構(gòu)變性[22-23]。蛋殼形成主要發(fā)生在夜間，此期間蛋雞停止進(jìn)食，蛋殼中鈣主要通過(guò)腸道吸收，25%~40%由骨骼提供[24]，當(dāng)飼糧中鈣含量不足時(shí)，蛋雞則通過(guò)吸收髓骨中鈣保證蛋殼形成[25]。因此，日糧中鈣含量較低促使蛋雞骨密度降低，反映骨密度和骨強(qiáng)度的龍骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)也顯著降低，抗骨折能力及骨強(qiáng)度下降，影響骨骼質(zhì)量，導(dǎo)致龍骨骨折和彎曲發(fā)生率增加。

礦物質(zhì)是組織和液體中普遍存在的無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)維持人類和動(dòng)植物某些物理化學(xué)過(guò)程非常必要。礦物元素（如鈣、鐵、磷）在骨礦化和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如鈣補(bǔ)充劑通過(guò)增加蛋雞和肉雞骨穩(wěn)態(tài)、骨密度和骨強(qiáng)度改善骨質(zhì)量。鈣磷是骨骼發(fā)育最重要礦物質(zhì)，鈣磷缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨結(jié)構(gòu)改變，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥[26]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低鈣日糧可降低蛋雞龍骨中鈣、鋰、汞和鎳含量，提高體內(nèi)鉀、鐵、銅、鍶、鉬、錳、鋅、釩、硒、鉈、鉛含量。某些礦物質(zhì)元素包括鉀、錳、鐵、鋅和硒對(duì)骨骼完整性和代謝均產(chǎn)生積極影響，當(dāng)飲食中缺乏礦物質(zhì)元素時(shí)對(duì)人和動(dòng)物骨含量和骨質(zhì)量產(chǎn)生不利影響[27]。研究發(fā)現(xiàn)，低鈣組蛋雞龍骨鉀、鐵濃度增加，這可能與膳食鈣缺乏引起骨損傷修復(fù)有關(guān)。鉀含量在骨折蛋雞龍骨中升高可能與其成骨作用，促進(jìn)骨折愈合有關(guān)[28]。

鐵是骨骼健康和發(fā)育基本元素，參與多種代謝過(guò)程，鐵過(guò)載或缺乏與骨吸收和形成不平衡導(dǎo)致的骨丟失呈正相關(guān)，反之說(shuō)明平衡良好，骨穩(wěn)態(tài)需最佳鐵含量[29]。本研究中低鈣飲食母雞龍骨鐵水平增加更可能促進(jìn)骨吸收，導(dǎo)致骨損失和骨質(zhì)量降低。鋅、硒是骨骼生長(zhǎng)發(fā)育重要元素，尤其在骨折愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究中鋅、硒含量增加可能與低鈣飼糧引起的龍骨骨折后愈合過(guò)程有關(guān)，骨折及其愈合期骨組織及其附著的肌肉組織發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，需鋅和硒等抗炎和抗氧化應(yīng)激元素蓄積。鋰元素促進(jìn)骨折愈合，而本試驗(yàn)中低鈣飼糧顯著降低鋰濃度，對(duì)龍骨骨折愈合產(chǎn)生不利影響。此外，鉛和汞為有毒元素，低鈣飲食蛋雞鉛含量增加對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害影響。綜上所述，長(zhǎng)期低鈣日糧誘導(dǎo)蛋雞龍骨骨元素濃度穩(wěn)態(tài)失衡。

4 結(jié)論

飼喂含1.5%有效鈣的低鈣日糧通過(guò)改變蛋雞龍骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)和破壞元素濃度平衡，降低骨骼質(zhì)量，導(dǎo)致龍骨損傷發(fā)生率升高，產(chǎn)蛋期蛋雞給予高鈣日糧有利于維持蛋雞龍骨健康。