鐘藝煊，周 佳，陳 革，王麗揚，王彥紅，劉學(xué)忠

(1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 , 江蘇 揚州 225009)

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，而沙門菌病的發(fā)生與流行一直影響著畜牧業(yè)的健康發(fā)展，是現(xiàn)階段養(yǎng)殖場重要的細菌性傳染病之一[1]。鼠傷寒沙門菌屬于沙門菌B群，是一種重要的人獸共患病病原，其感染率與發(fā)病率較高[2]。沙門菌有廣泛的宿主范圍，各年齡的動物均可以感染，通常侵害幼年和青年動物。鵝感染鼠傷寒沙門菌時，肝臟有明顯的腫大、壞死，顏色呈古銅色；消化道呈現(xiàn)不同程度的充血、水腫、出血及灶性壞死[3]；同時伴有明顯的心包炎和氣囊炎。目前，臨床主要通過抗生素來防治鼠傷寒沙門菌感染。由于不同地區(qū)分離得到的沙門菌有比較大的差異，部分養(yǎng)殖場不合理的使用抗生素，病原在比較長的時間內(nèi)進行演化，進而導(dǎo)致耐藥菌株的出現(xiàn)，加大了對沙門菌病的防治難度，對公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重的影響。本試驗通過收集臨床病料，進行病原分離和鑒定，開展藥敏試驗和相關(guān)耐藥基因的檢測，為鵝群鼠傷寒沙門菌病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料的來源 所用的病料分別是從安徽、泰州和鎮(zhèn)江送檢的疑似沙門菌感染的病鵝的病變組織。

1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基，購自杭州微生物制劑有限公司；沙門菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；腸桿菌科細菌生化管和藥敏紙片，包括慶大霉素(10 μg)、阿莫西林(20 μg)、丁胺卡那(30 μg)、卡那霉素(30 μg)、頭孢哌酮(75 μg)、頭孢曲松(30 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、復(fù)方新諾明(23.75/1.25 μg)、鏈霉素(10 μg)、多西環(huán)素(30 μg)、諾氟沙星(10 μg)、氟苯尼考(30 μg)、環(huán)丙沙星(5 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、多黏菌素B(300IU)、妥布霉素(10 μg)、美洛西林(75 μg)以及新霉素(30 μg)共18種 抗菌藥，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離 采集肝臟、心臟、關(guān)節(jié)液等病料，無菌接種于麥康凱培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑選生長良好的菌落，在麥康凱培養(yǎng)基上進一步純化培養(yǎng)。挑選純培養(yǎng)后的單個菌落，按照《獸醫(yī)微生物實驗指導(dǎo)》[4]要求進行革蘭染色，鏡檢，觀察細菌的形態(tài)以及顏色。

1.4 生化試驗 挑取純培養(yǎng)后的單個菌落，接種于腸桿菌科細菌生化管中，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)12 h。

1.5 沙門菌侵襲蛋白A(invA)基因的PCR鑒別試驗 通過特異性的親膜蛋白invA基因的PCR擴增試驗來鑒定沙門菌。所用的引物：F:5′-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3′；R:5′-GCATTATC-GATCAGTACCAGCCGTCT-3′[5]。PCR擴增體系為20 μL，模板為純化后的疑似沙門菌單菌落提取的DNA。擴增程序:95 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性35 s，57 ℃退火 35 s，72 ℃ 延伸40 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 終延伸7 min。將擴增后的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 血清學(xué)試驗 采用玻板凝集試驗來進行血清學(xué)分型。首先取一環(huán)A～F多價血清于載玻片上，再挑取適量待檢細菌，與之混合均勻，30 s內(nèi)觀察凝集情況。若產(chǎn)生顆粒狀凝集則判斷為陽性(反之，則為陰性)，陽性樣品再分別選用O∶4、O∶9、O∶12、O∶5、O∶7 等因子血清進行玻板凝集試驗，判定待檢細菌的群別。根據(jù)判斷的O抗原群別，進行H抗原的第一相和第二相判定。

1.7 藥敏試驗 取適量純培養(yǎng)后的細菌，用十字劃線法均勻涂在普通瓊脂培養(yǎng)基上，將藥敏試紙片輕輕貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑大小，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)動物種特異的獸醫(yī)病原菌抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)[6]進行判定。

1.8 β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因測定 挑取適量菌落，煮沸法制備細菌基因組模板。采用PCR擴增試驗進行β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因的檢測，測定基因為TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9，測定時需要使用的具體引物序列見表1。

表1 本試驗所用PCR引物

2 結(jié)果

2.1 細菌分離 采集的病料(表2)分離后，在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好，形成圓形、無色、大小均勻的菌落。將純化后的細菌進行革蘭染色，鏡檢可見革蘭陰性中等大小的直桿菌，這些都與革蘭陰性菌的鏡檢結(jié)果一致。

表2 細菌來源與血清型模式

2.2 生化試驗 結(jié)果顯示，10株分離株均不發(fā)酵乳糖，發(fā)酵麥芽糖，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不利用水楊甘、蔗糖，也不產(chǎn)生α甲基葡萄糖苷。不能分解尿素，不產(chǎn)生吲哚，V-P試驗陰性，甲基紅試驗陽性，在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生H2S，符合沙門菌的生化特性。

2.3invA基因的PCR鑒別試驗 以10株分離株的DNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果均出現(xiàn)大小約為330 bp的目的條帶(圖1)，與預(yù)期的片段大小相符，即分離株為沙門菌。

圖1 特異性親膜蛋白invA基因的PCR鑒別

2.4 血清學(xué)試驗 10株分離株的抗原模式全部與鼠傷寒沙門菌的抗原模式一致，為1，4，[5]，12：i，2，符合鼠傷寒沙門菌的抗原模式，均為鼠傷寒沙門菌(表2)。

2.5 藥敏試驗 10株鼠傷寒沙門菌分離菌株的藥敏試驗結(jié)果顯示(表3)，所分離的菌株對氟苯尼考的耐藥性為50%；對阿莫西林、美洛西林等藥物的耐藥性為30%；對環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢曲松等藥物的耐藥性為20%；但對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥性為0。且分離得到的20181226E1-3、20181226E1-4、20181226E1-S2、20181226E1-S3和20181226E1-T這5株分離株同時對喹諾酮類、氨基糖苷類、氯霉素類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類五類抗生素耐藥，為多重耐藥性菌株。

表3 分離株對不同抗菌藥物的耐藥情況

2.6 β-內(nèi)酰胺類抗生素相關(guān)耐藥基因測定 對10株鼠傷寒沙門菌進行β-內(nèi)酰胺酶類抗生素相關(guān)耐藥基因的檢測,結(jié)果顯示,20190111E1-1和20190111E1-2這2株鼠傷寒沙門菌分離株檢出CTX-M-9(圖2)，并且這2株都為CTX-M-65。TEM、SHV、CTX-M-1和CTX-M-2均未檢出。

圖2 CTX-M-9耐藥基因PCR擴增

3 討論

本試驗分離出的10株鼠傷寒沙門菌均來自鵝，有7株來自泰州，2株來自鎮(zhèn)江，1株來自安徽。沙門菌是一種嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的細菌性病原微生物[8]，對雛鵝的危害非常大。

藥敏試驗結(jié)果顯示，本次試驗分離得到的10株菌株中已有5株為多重耐藥菌株，而這5株分離株來自同一個養(yǎng)殖場。近年來，隨著3代頭孢菌素以及廣譜β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床的廣泛使用，革蘭陰性桿菌中β-內(nèi)酰胺酶的檢出率也日益增高[9]，CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶已經(jīng)取代SHV和TEM型β-內(nèi)酰胺酶，成為革蘭陰性桿菌中最常檢出的基因型[10]。由質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶可通過轉(zhuǎn)移接合作用(相同或不同種屬細菌間)導(dǎo)致耐藥基因的轉(zhuǎn)移和擴散[11]，嚴(yán)重時會導(dǎo)致耐藥菌株在局部大規(guī)模暴發(fā)[12]。本試驗在20190111E1-1和20190111E1-2分離株中檢測到耐藥基因CTX-M-9，2株分離株均來自同一養(yǎng)殖場，且耐藥表型為對頭孢噻肟和頭孢曲松均耐藥，其余8株分離株對頭孢噻肟和頭孢曲松均不耐藥，耐藥基因和耐藥表型的符合率為100%，這與余菊等[13]的沙門菌CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型及變異研究的結(jié)果相一致。

目前，尚且沒有特別有效的疫苗來預(yù)防鼠傷寒沙門菌，因此在養(yǎng)殖過程中，需要加強對沙門菌病的防治工作，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，具體體現(xiàn)在病畜出現(xiàn)死亡時及時剖檢進行細菌分離，并對分離菌株進行藥敏試驗，根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果制定科學(xué)合理的用藥方案。獸醫(yī)主管部門要與時俱進，制定有效的防控措施，并且嚴(yán)格貫徹執(zhí)行；平時加強對養(yǎng)殖戶的培訓(xùn)；種畜禽場要做好凈化工作，建立無沙門菌感染的種群[14]；加強對畜禽產(chǎn)品的檢疫工作，最終保障人類的健康。