徐紅梅 殷濤 趙青 羅治建 王建敏 汪如珍 熊琰

摘 要： Smal-007菌株分離自美國(guó)松材線蟲(chóng)體表，具有較好森防潛能。2018～2019年連續(xù)兩年在湖北省崇陽(yáng)縣項(xiàng)目示范區(qū)大面積噴灑Smal-007菌劑防治松材線蟲(chóng)，項(xiàng)目實(shí)施期間取得了較好的防治效果。

關(guān)鍵詞： 松材線蟲(chóng)病;生防細(xì)菌;防效

中圖分類號(hào)：S763.712?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1004-3020（2021）05-0024-04

Control Effect of Pine Wilt Disease Using A Biological Control Agent of Smal-007 in Chongyang，Hubei Province

Xu Hongmei（1） Yin Tao（2） Zhao Qing（2） Luo Zhijian（2） Wang Jianmin（3） Wang Ruzhen（3） Xiong Yan（2）

（ 1.Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075;

2.Hubei Forest Pest Control and Quarantine General Station Wuhan 430079;

3.Chongyang County Forest Pest Control Station Xianning 437521）

Abstract： The strain Smal-007 of Stenotrophomonas maltophilias was isolated From America as a biocontrol agent for controlling pine wilt disease.A large-scale experiment was performed in forest in Chongyang，Hubei Province.The spraying was performed for once a year，in 2018 and 2019，respectively.The number of wilting and dead pine tree was significantly reduced in experiment district.

Key words： Pine wilt disease;biocontrol bacteria;control effect

松材線蟲(chóng)病，又稱為松材線蟲(chóng)萎蔫病，被公認(rèn)為松樹(shù)的“癌癥”。松材線蟲(chóng)病主要分布于美國(guó)、加拿大、墨西哥、日本、中國(guó)、韓國(guó)、朝鮮、法國(guó)、尼日利亞和葡萄牙等多個(gè)國(guó)家[1]。中國(guó)自1982年首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病以來(lái)，該病已迅速蔓延至天津、遼寧、江蘇、安徽、廣東、浙江、湖北等18個(gè)行政區(qū)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)森林安全[2]。

美國(guó)是松材線蟲(chóng)病原產(chǎn)地，但很少有松樹(shù)大面積枯死。從病原、傳播媒介、寄主和環(huán)境等幾個(gè)影響松材線蟲(chóng)病流行的重要因素對(duì)比分析，很多學(xué)者認(rèn)為主要原因在于美國(guó)松材線蟲(chóng)致病力較弱，而研究表明這與其線蟲(chóng)體表附著的細(xì)菌有密切關(guān)系[3]。

南京林業(yè)大學(xué)從美國(guó)松材線蟲(chóng)體表分離篩選到一株嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomnas maltophilia Smal-007具有較好生防潛能：該菌致病力弱，定殖和替代能力強(qiáng)，對(duì)環(huán)境安全無(wú)毒[3-6]。目前，應(yīng)用該菌在安徽安慶、懷寧、當(dāng)涂、福建三明市開(kāi)展林間防治松材線蟲(chóng)試驗(yàn)，防治效果較好[7-9]。

近年來(lái)湖北省松材線蟲(chóng)病呈現(xiàn)快速擴(kuò)展蔓延態(tài)勢(shì)，防治松材線蟲(chóng)病的形勢(shì)十分嚴(yán)峻。湖北省林業(yè)局將“松材線蟲(chóng)病新型生防菌劑推廣示范”列為2017年度中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目。該項(xiàng)目于2018～2019年連續(xù)兩年在湖北省崇陽(yáng)縣項(xiàng)目示范區(qū)噴灑Smal-007菌劑防治松材線蟲(chóng)，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 示范區(qū)概況

本項(xiàng)目試驗(yàn)示范區(qū)位于湖北省崇陽(yáng)縣白霓鎮(zhèn)和桂花泉鎮(zhèn)。崇陽(yáng)縣地處湖北省南陲，居湘、鄂、贛三省交界處，位于北緯29°12～29°41，東經(jīng)113°43～114°21之間。亞熱帶季風(fēng)氣候，日照充足，溫和多雨，無(wú)霜期長(zhǎng)，年平均氣溫17.0 ℃，年均降雨量1 312 mm，試驗(yàn)示范區(qū)林分類型為針闊混交林，不同的小班樹(shù)種組成（闊葉樹(shù)種類、針闊比）有所不同?？傮w說(shuō)來(lái)，白霓鎮(zhèn)試驗(yàn)示范林以馬尾松Pinus massoniana為主，混有少量南酸棗Choerospondias axillaris、楓香樹(shù)Liquidambar formosana、苦櫧Castanopsis sclerophylla等闊葉樹(shù)種，桂花泉鎮(zhèn)試驗(yàn)示范林包含闊葉樹(shù)種比例稍高，闊葉樹(shù)種主要有苦櫧、南酸棗、柃木Eurya japonica、檫木Sassafras tzumu等。

1.2 樣地設(shè)置

2017年底完成樣地設(shè)置和防治前調(diào)查工作。樣地設(shè)置采用典型取樣法，即在白霓鎮(zhèn)、桂花泉鎮(zhèn)試驗(yàn)示范區(qū)內(nèi)按照不同的地形、坡度及林分狀況，有選擇性地設(shè)置樣地3個(gè)，大小為0.67 hm2。同時(shí)在附近未防治區(qū)，設(shè)置相同面積對(duì)照樣地1個(gè)，總共設(shè)置樣地8個(gè)。記錄每個(gè)樣地地貌（中山、丘陵、平原）、坡度、坡向、坡位、林分種類及經(jīng)營(yíng)等級(jí)（好、中、差）等基本情況。

每個(gè)樣地周圍設(shè)置固定標(biāo)識(shí)，樣地內(nèi)每株馬尾松編上編號(hào)并用紅色油漆標(biāo)識(shí)。每年5～10月，在每個(gè)樣地內(nèi)掛設(shè)APF-I誘捕器1個(gè)誘捕松墨天牛，用于定期監(jiān)測(cè)試驗(yàn)示范區(qū)松墨天牛數(shù)量變化及攜帶Smal-007生防菌情況。

1.3 供試菌株和菌劑制備

Smal-007菌株：從美國(guó)松材線蟲(chóng)體表分離，經(jīng)鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌，由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供。

將保存于NA平板上的Smal-007菌株劃線活化，挑取單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min于恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)36 h，作為種子液，將種子液倒入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵主要參數(shù)參照劉侃誠(chéng)方法進(jìn)行[7]。發(fā)酵好的Smal-007菌劑，裝入滅菌的25 kg塑料桶中保存運(yùn)輸。

1.4 噴施發(fā)酵液

2018～2019年5月噴施前密切留意天氣預(yù)報(bào)，選擇無(wú)雨的天氣進(jìn)行噴灑菌劑，盡量保證噴灑后48 h內(nèi)無(wú)降雨。2018年5月16日，在崇陽(yáng)縣項(xiàng)目示范區(qū)采用歐直小松鼠AS350B3直升機(jī)吊掛美國(guó)Laolaer3900-350B2農(nóng)林噴灑作業(yè)設(shè)備共飛行3個(gè)架次，每次裝藥800 kg，采取低容量噴霧，噴灑量為4.50～5.25 kg·hm-2，林間噴灑要求均勻全面，不留死角。2019年5月27日采用羅賓遜R44直升級(jí)吊掛美國(guó)農(nóng)林噴灑作業(yè)設(shè)備飛行13個(gè)架次，每次裝藥200 kg，噴灑方式和噴灑量與2018年相同。各試驗(yàn)林分別選取立地條件和發(fā)病條件基本相同的林地作為對(duì)照區(qū)。每年8～10月，對(duì)試驗(yàn)示范區(qū)松材線蟲(chóng)病枯死樹(shù)進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)合對(duì)照區(qū)病死樹(shù)情況，評(píng)價(jià)Smal-007林間防治效果。

防治效果計(jì)算方法如下：

枯死株降低率（%）=（防治前平均每公頃枯死株數(shù)-防治后平均每公頃枯死株數(shù)）/防治前平均每公頃枯死株數(shù)×100%;

防治效果（%）=[（100-對(duì)照區(qū)枯死降低率）-（100-防治區(qū)枯死降低率）]/（100-對(duì)照區(qū)枯死降低率）×100%。

1.5 生防菌林間定植檢測(cè)

噴灑Smal-007菌劑后當(dāng)年和第2年6～8月，在林間懸掛APF-I型引誘器誘捕松墨天牛，以選擇性培養(yǎng)基富集法，并結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)其攜帶的細(xì)菌來(lái)評(píng)估生防菌林間定殖情況。

制備選擇性培養(yǎng)基，將活天牛放入液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)36 h。吸取0.5 mL培養(yǎng)液于選擇性培養(yǎng)基平板中央，用細(xì)菌涂布均勻涂抹在平板表面。將平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，待菌落長(zhǎng)出后，根據(jù)菌落形態(tài)、大小進(jìn)行分類并統(tǒng)計(jì)各菌落比率。隨機(jī)挑取5個(gè)疑似Smal-007菌株，在NA平板上劃線純化，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，送至生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，完成細(xì)菌16SrDNA測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)選擇性培養(yǎng)和測(cè)序結(jié)果，計(jì)算各采集點(diǎn)天牛攜帶Smal-007菌株比率。以沒(méi)有噴灑菌劑林分誘捕到的松墨天牛作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑林間防治效果

2018年5月噴灑菌劑時(shí)，當(dāng)日天氣條件比較好，噴灑后36 h有降雨，雨量中等。2019年5月噴灑后48 h有降雨，雨量較大。分別于2017年、2018年和2019年10月底對(duì)試驗(yàn)地防治區(qū)和對(duì)照區(qū)進(jìn)行松材線蟲(chóng)病枯死樹(shù)調(diào)查，結(jié)果見(jiàn)表1。

2019年試驗(yàn)區(qū)所處鄂東南地區(qū)遭遇五十年一遇極端干旱天氣，崇陽(yáng)縣自7月14日以后，高溫少雨天氣持續(xù)幾個(gè)月，旱情十分嚴(yán)重，導(dǎo)致大量林木樹(shù)勢(shì)衰退甚至死亡。經(jīng)調(diào)查，2019年項(xiàng)目示范區(qū)內(nèi)有部分松樹(shù)因干旱枯死。對(duì)因干旱枯死與松材線蟲(chóng)致死松樹(shù)進(jìn)行了區(qū)分，統(tǒng)計(jì)防治效果時(shí)將前者剔除。

根據(jù)表1結(jié)果計(jì)算枯死株降低率和防治效果。由表2可知，飛機(jī)噴灑Smal-007菌劑的白霓鎮(zhèn)試驗(yàn)地，松樹(shù)枯死株數(shù)明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株降低率為86.67%，2019年較防治前（2017年）年松樹(shù)枯死株降低率為92.2%。對(duì)照區(qū)松樹(shù)枯死株率沒(méi)有降低。防治區(qū)與對(duì)照區(qū)相比，2018年防治效果為86.67%，2019年防治效果92.2%。飛機(jī)噴灑Smal-007菌劑的桂花泉鎮(zhèn)試驗(yàn)林，松樹(shù)枯死株數(shù)也顯著減少，2018年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株降低率為48.89%，2019年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株降低率為91.1%。對(duì)照區(qū)松樹(shù)枯死株降低率2018年和2019年均為11.11%。防治區(qū)與對(duì)照區(qū)相比，2018年防治效果為42.07%，2019年防治效果為90.1%。

2.2 生防菌林間定殖檢測(cè)結(jié)果

2018年和2019年6～8月，在試驗(yàn)林誘捕松墨天牛，檢測(cè)攜帶生防菌的松墨天牛數(shù)量，在此基礎(chǔ)上評(píng)估生防菌在林間的定植情況，結(jié)果見(jiàn)表3。

噴灑Smal-007菌劑當(dāng)年，總計(jì)誘捕到37頭活松墨天牛，其中9頭攜帶生防菌，攜帶生防菌天牛比例為24.3%;連續(xù)噴灑菌劑2年后，總計(jì)誘捕到41頭活松墨天牛，其中19頭攜帶生防菌，攜帶生防菌天牛比例為46.3%。未噴灑Smal-007菌劑的對(duì)照區(qū)誘捕到的天牛不攜帶生防菌。到由此看來(lái)，林間連續(xù)噴灑Smal-007菌劑兩年后，松墨天牛攜帶生防菌的比例逐步增加，表明該菌劑逐步在林間定殖和繁衍。

本項(xiàng)目監(jiān)測(cè)到攜帶Smal-007生防菌劑天牛比例比姚伍等人在福建三明市應(yīng)用Smal-007生防菌防治松材線蟲(chóng)時(shí)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)偏低，除了不同地區(qū)的林分、氣候等因素影響Smal-007生防菌定殖效果等原因，另一個(gè)重要影響因素為二者所使用的檢測(cè)方法不同：姚伍等人采用的用酶聯(lián)免疫儀抗體標(biāo)記法更加靈敏高效，而本項(xiàng)目采用的16SrDNA測(cè)序法相對(duì)更加耗時(shí)，工作量大，效率偏低。

3 結(jié)論與討論

研究人員推測(cè)，Smal-007生防菌通過(guò)替代松材線蟲(chóng)體表的產(chǎn)毒細(xì)菌，以使松材線蟲(chóng)喪失致病性，從而實(shí)現(xiàn)防治作用。Smal-007菌劑噴灑到林間后，可在松樹(shù)的針葉、樹(shù)皮甚至雜草表面定殖和繁衍。松墨天牛成蟲(chóng)在林間黏附生防菌。Smal-007極易在松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)體表繁殖，迅速替代其體表致病細(xì)菌，從而導(dǎo)致被生防菌定殖的松材線蟲(chóng)喪失致病能力。另外，由于攜帶生防菌的線蟲(chóng)產(chǎn)生毒素能力較低，不能致死松樹(shù)細(xì)胞，線蟲(chóng)也不易在樹(shù)體內(nèi)擴(kuò)大繁殖，傷口會(huì)慢慢愈合。

根據(jù)其作用原理，Smal-007生防菌防治效果受到以下因素制約：一是生防菌不能主動(dòng)侵入樹(shù)體殺死線蟲(chóng)，對(duì)已經(jīng)感染線蟲(chóng)并發(fā)病的松樹(shù)沒(méi)有治愈能力;二是Smal-007菌劑噴灑到林間后，需要一定的時(shí)間生長(zhǎng)繁殖，難以在短期內(nèi)被大量松墨天牛攜帶。顯著防效不僅要求連續(xù)2年噴灑菌劑，還要求一定的防治面積以達(dá)到規(guī)模效應(yīng)。另外Smal-007生防菌林間定殖和繁衍容易受到氣候因素影響，尤其是噴菌后48 h內(nèi)降雨會(huì)對(duì)細(xì)菌初步定殖產(chǎn)生影響，從而影響防治效果。

2018年白霓鎮(zhèn)示范區(qū)松樹(shù)枯死株數(shù)明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株率降低86.67%，防治效果為86.67%。2018年桂花泉鎮(zhèn)試驗(yàn)地，松樹(shù)枯死株數(shù)也明顯減少，2018年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株率降低48.89%，防治效果為42.07%。2018年桂花泉鎮(zhèn)防治效果稍低，主要影響因素有：一是桂花泉鎮(zhèn)示范區(qū)面積較小，只有91.13 hm2，未完全體現(xiàn)出規(guī)模效應(yīng);二是桂花泉鎮(zhèn)示范林松材線蟲(chóng)病防治前已經(jīng)發(fā)病嚴(yán)重，已經(jīng)感染松材線蟲(chóng)并發(fā)病的馬尾松數(shù)量偏多。

2019年白霓鎮(zhèn)示范區(qū)較防治前（2017年）年松樹(shù)枯死株率降低92.2%，防治效果為92.2%。2019年桂花泉鎮(zhèn)試驗(yàn)地，松樹(shù)枯死株數(shù)顯著減少，2019年較防治前（2017年）松樹(shù)枯死株率降低91.1%，防治效果為90.1%。

總體說(shuō)來(lái)，本項(xiàng)目在崇陽(yáng)縣白霓鎮(zhèn)和桂花泉鎮(zhèn)應(yīng)用Smal-007生防菌防治松材線蟲(chóng)，取得了較好的防治效果。

參 考 文 獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：唐 嵐）