王曦晗，邵 琨，安會(huì)敏，周佩軍，陳 冰**

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 1藥劑科；2 移植中心，上海200025

他克莫司（tacrolimus，TAC）是一種常用的免疫抑制藥物，目前已逐步替代環(huán)孢素成為主要使用的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑。它在臨床上常與霉酚酸和皮質(zhì)類激素合用、廣泛用于腎移植術(shù)后的免疫抑制治療。TAC 的生物利用度個(gè)體間差異較大，受肝臟和小腸首過(guò)效應(yīng)及紅細(xì)胞比例和血紅蛋白濃度的影響，TAC 的生物利用度可以從5%到90%，并且有著狹窄的治療窗口[1]。為了減少TAC 的腎毒性，提高其有效性，在常規(guī)進(jìn)行治療藥物濃度監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行個(gè)體化給藥是合理的手段。臨床上多對(duì)TAC 全血谷濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但谷濃度合適范圍內(nèi)的患者仍然存在毒性或排斥反應(yīng)，這說(shuō)明全血谷濃度與藥效學(xué)指標(biāo)或毒性發(fā)生之間的相關(guān)性存在爭(zhēng)議[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)約90%以上TAC 在進(jìn)入體循環(huán)后與紅細(xì)胞結(jié)合；但只有少量藥物能進(jìn)入淋巴細(xì)胞而發(fā)揮免疫抑制作用，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）內(nèi)TAC的變化可能是更好的監(jiān)測(cè)指示[3]。Capron A 等[4]研究了96 例腎移植患者的細(xì)胞內(nèi)TAC 濃度，發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率與低水平的細(xì)胞內(nèi)TAC 濃度之間存在關(guān)聯(lián)性。在另一項(xiàng)針對(duì)肝移植患者的研究中，移植后一周出現(xiàn)臨床排斥反應(yīng)的患者TAC 的PBMC濃度明顯低于未出現(xiàn)排斥反應(yīng)的患者[5]。TAC 在體內(nèi)的暴露量能更好地反映藥效與毒性。藥時(shí)曲線下面積（AUC）被認(rèn)為是目前反映藥物暴露量的一個(gè)最佳標(biāo)志[6]。精準(zhǔn)計(jì)算AUC 需要在服藥期間采集大量的標(biāo)本（8～12 個(gè)采血點(diǎn)），但是這在臨床實(shí)踐中較為困難。有限取樣法（limited sampling strategy，LSS）的策略，通過(guò)采集少量標(biāo)本（2～4 個(gè)采血點(diǎn)）可對(duì)AUC0～12h進(jìn)行較準(zhǔn)確地估算[7]。基于以上觀點(diǎn)，本研究擬通過(guò)利用多元線性回歸法，建立一個(gè)LSS 模型，用于估算中國(guó)腎移植患者PBMC 內(nèi)TAC 的AUC0～12h，以達(dá)到優(yōu)化個(gè)體化給藥的目的。

1 材料和方法

1.1 對(duì)象與方案

選擇2017～2018 年在本院器官移植中心進(jìn)行腎移植的患者，術(shù)后均采用TAC+霉酚酸+皮質(zhì)類激素的三聯(lián)免疫抑制方案：術(shù)后口服TAC（商品名：樂(lè)可復(fù)，安斯泰來(lái)制藥）0.1 mg·kg-1·d-1，每日2 次，調(diào)整劑量使谷濃度維持在10～13 ng·mL-1；術(shù)前6 h 內(nèi)口服霉酚酸酯（商品名：驍悉，瑞士諾華制藥）1000 mg，術(shù)后每日1000 mg、給藥2 次，并根據(jù)患者霉酚酸暴露量調(diào)整劑量；術(shù)中使用甲潑尼龍500 mg iv gtt，術(shù)后第1～7 天將甲潑尼龍280 mg 逐漸遞減至40 mg iv gtt，以后改用口服潑尼松20 mg·d-1。術(shù)后達(dá)穩(wěn)態(tài)采集患者服用TAC 后全血分離PBMC。

試驗(yàn)方案獲本院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書。

1.2 材料和儀器

他克莫司對(duì)照品（批號(hào)：20111101，純度：98%）和內(nèi)標(biāo)子囊霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20111117，純度：98.5%）均購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液（批號(hào)：10291481）購(gòu)于通用電氣醫(yī)療集團(tuán)（GE 醫(yī)療生命科學(xué)部）；20×PBS 緩沖液（批號(hào)：FC16KA4123）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（色譜級(jí)）購(gòu)自Tedia（費(fèi)爾菲爾德，美國(guó)）；甲酸銨為分析純。

API 4000 型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司），配備電噴霧離子化源（ESI）；UFLC色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；BS224S 型萬(wàn)分之一精密天平（德國(guó)Sartorius 公司）；Eppendorf 5804R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）。

1.3 患者PBMC 樣本采集

腎移植術(shù)后2 周，患者達(dá)到穩(wěn)態(tài)。在服藥前和服藥后0、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 經(jīng)肘靜脈采血3～5 mL 置于EDTA 抗凝管中，采用梯度密度離心法，收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)患者PBMC，細(xì)胞計(jì)數(shù)后置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 樣本測(cè)定

患者PBMC 內(nèi)TAC 的濃度采用前期建立的LC-MS/MS 法進(jìn)行檢測(cè)。色譜條件：采用Zorbax C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）[8]；流動(dòng)相：由A 相（2 mmol·L-1甲酸銨水溶液）與B 相（2 mmol·L-1甲酸銨甲醇溶液）組成，A 相與B 相比例如下：20%B（0～0.5 min），20%～100%B（0.5～1.5 min），100%B（1.5～5min），100%～20%B（5～6min）和20%B（6～7min）；柱溫：40 ℃；流速：0.35 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化電離源（ESI），正離子方式檢測(cè)；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度500 ℃；GS1 壓力：275.79 kPa；GS2 壓力：275.79 kPa；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；TAC 和子囊霉素的離子對(duì)分別為m/z 821.7 →m/z 768.5 和m/z 809.6→m/z 756.5；解簇電壓（DP）分別為：101.7 eV 及97.7eV；碰撞能量（CE）分別為：10.6 eV 及10.5 eV。碰撞室射出電壓（CXP）分別為：10.7 V 和10.4 V。

該方法經(jīng)過(guò)體內(nèi)藥物分析方法學(xué)指標(biāo)的驗(yàn)證，結(jié)果均滿足生物樣本的檢測(cè)要求。

1.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算

采用WinNonlin 軟件以非房室法計(jì)算TAC 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。依據(jù)線性梯形法則計(jì)算用藥后0～12 h 患者PBMC 中TAC 的AUC，Cmax、Tmax和AUC0～12h均為實(shí)際測(cè)量值。

1.6 LSS 模型的建立和驗(yàn)證

依據(jù)線性梯形法則計(jì)算用藥后0～12 h 患者PBMC 中TAC 的藥-時(shí)曲線下面積AUC0～12h的實(shí)測(cè)值。采用SPSS 25.0 和SAS 9.13 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

采用逐步多元線性回歸分析（MRA）方法估算TAC PBMC 內(nèi)AUC0～12h的模型方程，以決定系數(shù)r2最大為最優(yōu)準(zhǔn)則。以1～4 個(gè)點(diǎn)的TAC 的PBMC 內(nèi)濃度作為自變量，以AUC0～12h為因變量，按照下面公式估算TAC 的AUC0～12h確定TAC AUC0～12h簡(jiǎn)化計(jì)算模型方程：

其中，b 為截距，Mi為偏相關(guān)系數(shù)，Cti為采樣時(shí)間點(diǎn)為ti時(shí)PBMC 內(nèi)的TAC 濃度。

預(yù)測(cè)誤差（prediction error，PE）和絕對(duì)預(yù)測(cè)誤差（absolute prediction error，APE）計(jì)算公式如下（式1 和式2），其中AUC（0～12）Obs和AUC（0～12）Est分別表示為AUC0～12h的觀測(cè)值和估算值。并計(jì)算平均預(yù)測(cè)誤差（MPE）表示模型的準(zhǔn)確度（式3），計(jì)算平均絕對(duì)預(yù)測(cè)誤差（MAPE）代表模型的精密度（式4）。MPE與MAPE 值應(yīng)分別小于10%和15%[9]。另外采用Bland-Altamn 方法評(píng)估AUC0～12h觀測(cè)值和AUC0～12h估算值之間的一致性，其界限表示為x±1.96 SD。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本信息

本研究共納入了23 例腎移植術(shù)后患者，其中女性為9 人，男性14 人。患者基本特征見(jiàn)表1。23例腎移植患者經(jīng)多次給藥達(dá)穩(wěn)態(tài)后的藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖1。AUC0～12h（23.18±14.52）ng·h/million PBMC，C0（1.28±0.88）ng/million PBMC，Cmax（3.73±2.31）ng/million PBMC，Tmax（4.79±3.08）h。TAC PBMC 和全血中谷濃度的相關(guān)性較弱（r2=0.1567，P=0.056）。

圖1 中國(guó)腎移植患者TAC PBMC 內(nèi)的藥物濃度-時(shí)間曲線

表1 24 例腎移植患者的基本情況和實(shí)驗(yàn)室檢查

2.2 有限取樣模型的建立

以梯形法計(jì)算患者實(shí)測(cè)TAC 的AUC0～12h，利用多元線性回歸擬合1～4 個(gè)采血點(diǎn)TAC 之AUC0～12h估算模型，篩選出決定系數(shù)r2較大的不同采血點(diǎn)的模型1～17，結(jié)果見(jiàn)表2。然而發(fā)現(xiàn)C0與AUC0～12h之間的相關(guān)性并不好（r2=0.570），模型引入峰濃度的影響（C0h-C6h）后相關(guān)性有所改善（r2=0.820）；但并未達(dá)到預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（MPE=2.48±19.71，MAPE=17.03±9.37）。相比于單點(diǎn)法或二點(diǎn)法，三點(diǎn)法或四點(diǎn)法相關(guān)性更好，且誤差較小。結(jié)合臨床因素和r2最大、最優(yōu)原則，最終選擇相對(duì)最優(yōu)模型作后續(xù)評(píng)價(jià)。

表2 多元線性回歸法估算細(xì)胞內(nèi)TAC AUC0～12h 的LSS預(yù)測(cè)模型

2.3 模型的方案評(píng)價(jià)

采用Bland-Altman 分析方法評(píng)價(jià)4 組模型AUC0～12h觀測(cè)值和AUC0～12h模型預(yù)測(cè)值之間的一致性（見(jiàn)圖2）。從圖2 中可看見(jiàn)模型4、9、14、17 的觀測(cè)值與預(yù)測(cè)值的差值多數(shù)在觀測(cè)值的2 個(gè)SD 以內(nèi)，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)誤差較小。進(jìn)一步通過(guò)bootstrap分析對(duì)所得到的LSS 模型進(jìn)行驗(yàn)證，該分析是從原始數(shù)據(jù)集中生成1000 個(gè)復(fù)制數(shù)據(jù)集，用于評(píng)價(jià)不同模型的穩(wěn)定性及參數(shù)估算的準(zhǔn)確性（見(jiàn)表3）。從這些數(shù)據(jù)上看，平均值和95%CI 與原始數(shù)據(jù)集的估算參數(shù)具有可比性。結(jié)果表明，所選擇的模型在準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性方面都是可以接受的。

圖2 Bland-Altman 分析法評(píng)價(jià)模型4、9、14、17 估算的

TAC AUC0～12h觀測(cè)值和AUC0～12h估算值間的一致性

3 討論

對(duì)于接受TAC 治療的患者而言，維持一個(gè)合適的藥物水平以避免移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生和藥物相關(guān)的毒性作用是至關(guān)重要的。雖然有些研究已成功建立了TAC 全血AUC0～12h有限取樣模型[10、11]。循環(huán)內(nèi)大部分的TAC 都與紅細(xì)胞結(jié)合，由于受到患者個(gè)體間紅細(xì)胞壓積的差異（31%～49%）及紅細(xì)胞藥物結(jié)合能力差異等因素的影響[12]，全血中TAC 不同患者之間差異較大[13]。TAC 通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞內(nèi)CaN活性，進(jìn)而影響T 細(xì)胞活性，達(dá)到免疫抑制的效果。因此與全血濃度相比，淋巴細(xì)胞內(nèi)藥物濃度可能與藥物療效聯(lián)系更為緊密。T 淋巴細(xì)胞是PBMC 的重要組成部分，其中CD4+T 細(xì)胞占PBMC 的60.2%[14]。評(píng)估淋巴細(xì)胞內(nèi)TAC 需要一個(gè)復(fù)雜的提取過(guò)程，而PBMC 可以作為監(jiān)測(cè)的首選基質(zhì)；但基于TAC 的PBMC 內(nèi)的有限取樣模型尚未見(jiàn)報(bào)道。有共識(shí)表明，對(duì)于TAC 全血AUC0～12h而言，維持150～200 ng·mL-1·h-1[15]。但目前TAC PBMC 的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果之間研究有限，AUC0-12h范圍與臨床之間的關(guān)系還不完全清楚。監(jiān)測(cè)全血谷濃度是臨床上估算全血中TAC 暴露量的常規(guī)做法；但是發(fā)現(xiàn)在PBMC 中，C0與AUC0-12h之間僅存在中等相關(guān)（r2=0.570），且預(yù)測(cè)值存在較大的偏差，表明C0只是AUC0～12h的部分反映。隨著更多取樣點(diǎn)的加入，模型的預(yù)測(cè)的精密度和準(zhǔn)確性更好，因?yàn)榘嗟娜狱c(diǎn)的模型提供了更大的相關(guān)性。對(duì)此也分析了包括1～4 個(gè)不同時(shí)間采樣點(diǎn)的LSS 模型，結(jié)果表明，1、2、3、4 個(gè)采樣點(diǎn)分別以C6h（r2=0.787 0）、C0.5h-C6h（r2=0.849 0）、C2h-C4h-C6h（r2=0.974 0）、C2h-C4h-C6h-C10h（r2=0.989 0）為最佳模型。TAC 峰濃度附近采樣點(diǎn)例如C4h和C6h對(duì)模型的預(yù)測(cè)至關(guān)重要。模型方程14（C2h-C4h-C6h）和17（C2h-C4h-C6h-C10h）優(yōu)于其他，選取其他采樣時(shí)間點(diǎn)的包含3或4 時(shí)間點(diǎn)的模型方程。模型方程14 和17 的MPE和MAPE 分別為-0.00±10.24%與0.00±8.24%，7.82±6.38%與6.08±5.40%。需要注意的是，特別是對(duì)于門診隨訪的患者而言，給藥后10 h 采集標(biāo)本并不方便。因?yàn)槟Ｐ头匠?4（C2h-C4h-C6h）和17（C2h-C4h-C6h-C10h）具有更為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性能，可能對(duì)依賴于準(zhǔn)確估算PBMC 內(nèi)TAC AUC0～12h來(lái)調(diào)節(jié)劑量的住院患者具有更大的價(jià)值。C0.5h-C6h也有較好的精確度和較低的偏差（MAPE<10.57%，76.47%的預(yù)測(cè)PE 值在±15%范圍內(nèi)）。這個(gè)模型可能更適合需要在較短時(shí)間內(nèi)采集標(biāo)本的門診隨訪患者。

本研究尚存在著一些缺陷，首先僅有23 例完整藥-時(shí)曲線標(biāo)本，數(shù)據(jù)并沒(méi)有分成模型組和驗(yàn)證組。其次，LSS 模型建立是基于接受包括TAC 在內(nèi)的三聯(lián)免疫抑制治療，沒(méi)考慮無(wú)合并類固醇患者的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。有研究表明，糖皮質(zhì)激素可能會(huì)通過(guò)影響細(xì)胞色素3A 或p-糖蛋白，而影響TAC 的暴露；但是，糖皮質(zhì)激素對(duì)PBMC 內(nèi)TAC 藥代動(dòng)力學(xué)的影響還仍然未可知。盡管存在這些局限性，本研究已清楚地表明，與監(jiān)測(cè)TAC 谷濃度相比，有限取樣模型在預(yù)測(cè)TAC 暴露量方面可能更為準(zhǔn)確。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究成功建立了基于少量取樣點(diǎn)的可靠的多元回歸分析，估計(jì)TAC 的PBMC 內(nèi)AUC0～12h的LSS 模型。內(nèi)部驗(yàn)證法證明：該方法在取樣時(shí)間方面有更好的靈活性，且具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，估算方程簡(jiǎn)單，適用于臨床上操作和推廣。