薛強(qiáng)　王燕飛　盛萬里　陳艷　金涌　鄒明強(qiáng)

摘? ? 要：為快速獲取與鑒定黃瓜基因組DNA，建立一種基于纖維素膜吸附的黃瓜基因組DNA快速提取方法，以市售華北型黃瓜為材料，制備纖維素膜片，篩選黃瓜裂解試劑，優(yōu)化提取反應(yīng)條件，建立了包括黃瓜裂解、膜片吸附、膜片清洗、核酸洗脫等步驟的黃瓜基因組DNA提取方法，可以在5 min內(nèi)從黃瓜果實(shí)中提取基因組DNA用于PCR擴(kuò)增。黃瓜果實(shí)的表皮、表層果肉和中心果肉都可以實(shí)現(xiàn)基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增，最少可以從13 mg黃瓜果實(shí)中提取并檢測到黃瓜管家基因Act1片斷。利用膜吸附DNA提取技術(shù)實(shí)現(xiàn)了黃瓜基因組DNA的快速提取，為黃瓜基因研究與快速鑒定提供了一種簡便方法。

關(guān)鍵詞：黃瓜;膜吸附;基因組DNA提取

中圖分類號：S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-039-05

A rapid extraction method of cucumber genomic DNA based on cellulose membrane adsorption

XUE Qiang1， WANG Yanfei2， SHENG Wanli3， CHEN Yan1， JIN Yong1， ZOU Mingqiang1

（1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123， China; 2. Solid Waste and Chemicals Management Center， Ministry of Ecology and Environment of the People's Republic of China， Beijing 100029， China; 3. Technical Center of Hohhot Customs District， Hohhot 010020， Inner Mongolia， China）

Abstract： In order to quickly obtain and identify cucumber genomic DNA， a rapid extraction method of cucumber genome DNA based on cellulose membrane adsorption is established. After preparation of cellulose membrane， development of lysis reagents， optimization of extraction conditions， a method includes cucumber lysis， membrane adsorption， membrane cleaning and nucleic acid elution was established. Genomic DNA of cucumber fruit could be extracted in 5 min and directly used for PCR amplification. Genomic DNA could be extracted from cucumber fruit epithelium， surface flesh and central flesh. And house-keeping gene Act1 fragments can be amplified from the 13 mg of cucumber fruit. Cucumber genomic DNA could be extracted quickly by using membrane adsorption DNA technology. It provides an easy method to research and rapid identification of cucumber gene.

Key words： Cucumber;Membrane adsorption;DNA extraction

黃瓜是遍布世界的重要蔬菜，黃瓜基因組計(jì)劃已經(jīng)完成，基因組學(xué)研究方法正在如火如荼地展開，在抗病性、抗蟲害、抗逆性、抗除草劑、品質(zhì)改良等方面進(jìn)行了多項(xiàng)研究[1]，在涉及黃瓜基因的眾多研究與鑒定方法中，對黃瓜基因組DNA的檢測鑒定是最常用到的試驗(yàn)方法。

在黃瓜DNA的檢測鑒定中，首先要提取黃瓜基因組DNA，目前常用的提取方法是CTAB法[2]和SDS法[3]，都要以新鮮葉片為原材料，需要研磨和離心等步驟，費(fèi)時費(fèi)力，而且市售的黃瓜一般也不帶有葉片，直接用黃瓜果實(shí)進(jìn)行提取和鑒定更為便利。商品化試劑盒多采用硅膜吸附離心法與磁珠吸附法。應(yīng)用硅膜吸附離心法，在高濃度超離液鹽存在的情況下將黃瓜裂解后游離的基因組DNA與固體硅膜支撐物結(jié)合，然后通過一系列清洗和離心步驟去除雜質(zhì)，最后在低濃度鹽溶液中從硅膜洗脫核酸[4]。而磁珠吸附法是在磁珠表面進(jìn)行官能團(tuán)修飾[5-7]，實(shí)現(xiàn)與核酸吸附，然后利用磁鐵吸附磁珠分離和去除雜質(zhì)，最后將磁珠上的核酸洗脫[8]。2種方法都需要多個步驟，需要熟練的操作人員和配套的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。此外，纖維素膜吸附法也可以用于核酸的提取[9]，修飾后的纖維素膜可以從人血液里提取基因組DNA[10]，也可以在多種生物體里實(shí)現(xiàn)核酸快速提取[11]，還可以用于法醫(yī)工作中DNA證物的長期保存[12]。膜吸附核酸提取法操作簡便快速，不需要離心機(jī)、磁鐵等輔助設(shè)備。DNA提取膜吸附法具有很大的應(yīng)用潛力，但是目前還沒有在黃瓜等蔬菜的基因組DNA提取中應(yīng)用。筆者自2020年6—12月，在中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院快速檢測技術(shù)實(shí)驗(yàn)室從裂解液開發(fā)、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)條件等方面進(jìn)行研究，建立了黃瓜基因組的膜吸附快速提取方法。

肌動蛋白是黃瓜細(xì)胞骨架的重要組成成分，在維持細(xì)胞生長、分化、繁殖等方面都發(fā)揮重要作用，肌動蛋白基因Act1作為管家基因常被用作基因組DNA檢測中的內(nèi)參基因[13-14]，Act1基因在黃瓜組織細(xì)胞中大量穩(wěn)定表達(dá)，在單倍體基因組上呈單拷貝存在，筆者選擇Act1作為標(biāo)示基因來開展黃瓜基因組DNA的快速提取研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黃瓜購自菜市場，果實(shí)細(xì)長，渾身有白刺，屬華北型黃瓜。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將黃瓜分割為表皮、表層果肉與中心果肉，每個部分切割為100 mg的小塊，分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?00 mg黃瓜表層果肉，采用全式金生物公司的商品化植物基因組DNA提取試劑盒（貨號EE111）提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?，提取產(chǎn)物作為試驗(yàn)中陽性對照樣品。用打孔器將纖維素膜制成3 mm直徑圓形膜片備用。

1.2.2 PCR反應(yīng)液配制與擴(kuò)增產(chǎn)物分析 參考李楠楠[14]的研究，選取黃瓜Act1基因作為目標(biāo)基因，參照其基因序列（GenBank：DQ115881.1）使用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物hg ACT1 F：5'GTGGTGGTGAATGAGTAGCC3'，下游引物hg ACT1 R：5'TTGGATTCTGGTGATGGTGTC3'，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150 bp，Tm值為60 ℃。按照PCR試劑盒（全式金生物公司，貨號AS111-02：）說明書配制PCR反應(yīng)液20 μL，其中2×PCR Mix：10.0 μL，上游引物0.5 μL（10 μmol·L-1），下游引物0.5 μL（10 μmol·L-1），水：9.0 μL。在陽性對照管中加入0.5 μL 商品化試劑盒提取的黃瓜基因組DNA，陰性對照管中加入0.5 μL清洗緩沖液。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)。反應(yīng)完成后PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.3 黃瓜基因組DNA提取與PCR反應(yīng) 將黃瓜樣品置于1.5 mL離心管中，用玻璃棒研磨至無大塊組織，加入100 μL裂解液，充分混勻，室溫放置1 min，用鑷子加入膜片，確保膜片完全浸入液體中，室溫放置1 min，用鑷子將膜片取出轉(zhuǎn)移到含有500 μL清洗緩沖液中（10 mmol·L-1 Tris[pH8.0]，0.1% Tween-20）的小管中，室溫放置1 min，再將膜片轉(zhuǎn)移到含有Act1基因上下游引物的PCR反應(yīng)液中，室溫孵育1 min，用鑷子去除膜片，進(jìn)行PCR反應(yīng)。操作流程見圖1。

1.2.4 黃瓜裂解液的篩選 以鹽酸胍、PVP、CTAB等植物常用基因組DNA提取試劑為主要成分，參照文獻(xiàn)[15-17]配制5種裂解液各1 mL，各種裂解液的試劑組成與濃度如表1所示。

將5份分割好的黃瓜表層果肉分別放置于5個1.5 mL離心管中，用玻璃棒研磨至無大塊組織，分別加入100 μL裂解液1～5，按照1.2.3的方法進(jìn)行基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析。

1.2.5 黃瓜基因組DNA提取條件的優(yōu)化 在黃瓜裂解時間的優(yōu)化中，取黃瓜表層果肉4份，每份100 mg，按照1.2.3方法進(jìn)行基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增，裂解時間分別設(shè)置為1、2、4、8 min。在膜片吸附時間的優(yōu)化中，取黃瓜表層果肉4份，每份100 mg，按照1.2.3方法進(jìn)行基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增，膜片吸附時間分別設(shè)置為1、2、4、8 min。在洗脫時間的優(yōu)化中，取黃瓜表層果肉3份，每份100 mg，按照1.2.3方法進(jìn)行基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增，洗脫時間分別設(shè)置為1、2、4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后進(jìn)行比較分析。

1.2.6 黃瓜不同部位基因組DNA提取檢測靈敏度測定 分別取50、25、13、6 mg黃瓜表皮、表層果肉與中心果肉放入小管中，用玻璃棒研磨至無大塊組織，在各管中分別加入100 μL裂解液1，按照1.2.3方法進(jìn)行基因組DNA提取和Act1基因片斷擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同裂解液對黃瓜基因組DNA提取的影響

在配制的5種裂解液中，只有裂解液1實(shí)現(xiàn)了有效擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷大小約為150 bp，符合產(chǎn)物預(yù)期大小，無非特異性條帶出現(xiàn)（圖2）。

2.2 不同提取時間對黃瓜基因組DNA擴(kuò)增的影響

在設(shè)置的1、2 、4 、8 min的黃瓜裂解時間中，擴(kuò)增產(chǎn)物量沒有明顯差異，都可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增（圖3），所以在后續(xù)試驗(yàn)中將黃瓜裂解時間確定為1 min。

濾膜片吸附時間從1 min到8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物量沒有明顯差異，都可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增（圖4）。濾膜片洗脫時間從1 min到4 min擴(kuò)增產(chǎn)物量沒有明顯差異，都可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增（圖5）。濾膜片吸附1 min和洗脫1 min都可以實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增。

2.3 不同黃瓜果實(shí)部位對膜吸附提取黃瓜基因DNA靈敏度的影響

在黃瓜表皮的基因組DNA提取靈敏度試驗(yàn)中，50 mg表皮、25 mg表皮和13 mg表皮都實(shí)現(xiàn)了有效擴(kuò)增，可見特異性擴(kuò)增片段，而且呈漸弱趨勢，6 mg表皮未實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，黃瓜表皮最少在13 mg可以實(shí)現(xiàn)有效提取與擴(kuò)增（圖6）。在黃瓜表層果肉的基因組DNA提取靈敏度試驗(yàn)中，50 mg表層果肉、25 mg表層果肉和13 mg表層果肉都實(shí)現(xiàn)了有效擴(kuò)增，而且呈漸弱趨勢，6 mg表層果肉未實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，黃瓜表層果肉最少在13 mg可以實(shí)現(xiàn)有效提取與擴(kuò)增（圖7）。在黃瓜中心果肉的基因組DNA提取靈敏度試驗(yàn)中，50 mg中心果肉、25 mg中心果肉實(shí)現(xiàn)了有效擴(kuò)增，13 mg和6 mg中心果肉未實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，黃瓜中心果肉最少在25 mg可以實(shí)現(xiàn)有效提取與擴(kuò)增（圖8）。

3 討論與結(jié)論

在簡單快速的基因組DNA提取方法中，常用的有高溫裂解法[18]、溶液直接裂解法[19]和纖維素膜片法[9]等。高溫裂解法通過加熱來破壞生物體組織結(jié)構(gòu)，使核酸釋放。高溫裂解法需要加熱設(shè)備，而且高溫容易使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)將核酸包裹使其不易釋放[20]，而且高溫也會加速核酸降解。溶液直接裂解法使用強(qiáng)變性溶液直接破壞生物體組織結(jié)構(gòu)，使核酸釋放。溶液在裂解組織釋放核酸的同時，溶液成分也會滯留在含有核酸的混合液中，從而影響核酸的后續(xù)試驗(yàn)操作，這樣的組織裂解混合液常常含有抑制DNA擴(kuò)增的成分[21]。本研究的目的就是在簡單的基因組DNA提取方法和能夠?qū)崿F(xiàn)PCR有效擴(kuò)增之間尋找一個平衡點(diǎn)。直接將黃瓜果實(shí)研磨裂解無法擴(kuò)增獲得Act1基因片斷（試驗(yàn)結(jié)果未展示），這可能是溶液里含有PCR反應(yīng)抑制成分，或者內(nèi)源性核酸酶降解了核酸。用簡單提取方法獲得的基因組DNA一般得率低、純度低、雜質(zhì)多，而且往往含有較多的PCR擴(kuò)增抑制成分。就像黃瓜裂解后的狀態(tài)，裂解液中有游離的DNA，但也有大量的內(nèi)源性核酸酶等雜質(zhì)，無法直接作為模板來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。筆者利用纖維素膜片對基因組DNA進(jìn)行吸附，再經(jīng)過清洗和洗脫獲得DNA，雖然這種DNA純度低、含量少，也會含有雜質(zhì)，但去除了PCR抑制物，可以作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了簡單快捷的目的。特異性核酸片斷得到擴(kuò)增放大后就可以實(shí)現(xiàn)多種下游試驗(yàn)操作。

在本研究選用的多種裂解液中，只有含有鹽酸胍的裂解液實(shí)現(xiàn)了黃瓜基因組DNA的提取和有效擴(kuò)增。鹽酸胍可以溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)與核蛋白二級結(jié)構(gòu)破壞，基因組得以釋放，同時，鹽酸胍也是內(nèi)源性核酸酶的強(qiáng)抑制劑，可以保護(hù)核酸免受降解[22]。裂解液裂解了黃瓜組織細(xì)胞，釋放了基因組DNA，被膜片吸附，DNA在洗脫液中得到洗脫。

在試驗(yàn)操作過程中，黃瓜的裂解、DNA的吸附和洗脫都在很短的時間內(nèi)就可以完成，充分滿足了快速提取基因組DNA的需求。黃瓜果實(shí)較大，容易獲取，本方法最少可以檢測到13 mg黃瓜果實(shí)，檢測靈敏度可以滿足絕大部分的應(yīng)用需求。黃瓜基因組DNA的提取僅需簡單的步驟和少量的試劑，不需要其他儀器或復(fù)雜設(shè)備，可以在田間地頭、市場菜站等場所直接提取基因組DNA，將吸附有基因組DNA的膜片帶回實(shí)驗(yàn)室再進(jìn)行擴(kuò)增檢測。這一研究為黃瓜基因組DNA的快速采集與鑒定提供了一種簡便方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 張圣平，顧興芳.黃瓜重要農(nóng)藝性狀的分子生物學(xué)[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（1）：117-121.

[2] CLARKE J D.Cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） DNA miniprep for plant DNA isolation[J]. Cold Spring Harbor Protocols，2009（3）：5177.

[3] 趙春梅，郭晶.黃瓜基因組DNA的提取方法篩選與優(yōu)化研究[J].吉林農(nóng)業(yè)，2019（12）：56.

[4] MARKO M A，CHIPPERFIELD R，BIRNBOIM H C.A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder[J].Analytical Biochemistry，1982，121（2）：382-387.

[5] LI X，ZHANG J X，GU H C.Adsorption and desorption behaviors of DNA with magnetic mesoporous silica nanoparticles[J].Langmuir，2011，27（10）：6099-6106.

[6] NAKAGAWA T，HASHIMOTO R，MARUYAMA K，et al. Capture and release of DNA using aminosilane-modified bacterial magnetic particles for automated detection system of single nucleotide polymorphisms[J].Biotechnology and Bioengineering，2006，94（5）：862-868.

[7] YOSHIKAWA K.Controlling the higher-order structure of giant DNA molecules[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52（3）：235-244.

[8] LEVISON P R，BADGER S E，DENNIS J，et al.Recent developments of magnetic beads for use in nucleic acid purification[J].Journal of Chromatography A，1998，816（1）：107-111.

[9] JANGAM S R，YAMADA D H，MCFALL S M，et al.Rapid， point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR[J].Journal of Clinical Microbiology，2009，47（8）：2363-2368.

[10] MANDAL G，DAS S，PADMANABHAN S.Development of a membrane-based method for isolation of genomic DNA from human blood[J].Journal of Biomolecular Techniques，2018，29（2）：46-53.

[11] ZOU Y P，MASON M G，WANG Y L，et al.Nucleic acid purification from plants， animals and microbes in under 30 seconds[J].PLOS Biology，2017，15（11）：e2003916.

[12] CHUMWANGWAPEE S，CHINGSUNGNOEN A，SIRI S.A plasma modified cellulose-chitosan porous membrane allows efficient DNA binding and provides antibacterial properties：A step towards developing a new DNA collecting card[J].Forensic Science International：Genetics，2016，25：19-25.

[13] WARZYBOK A，MIGOCKA M.Reliable reference genes for normalization of gene expression in cucumber grown under different nitrogen nutrition[J].PLoS One，2013，8（9）：e72887.

[14] 李楠楠.黃瓜CsFBXL基因啟動子的克隆及黃瓜生長發(fā)育中實(shí)時熒光定量PCR分析內(nèi)參基因篩選[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[15] GHAFFARIYAN S，MOHAMMADI S A，AHARIZAD S.DNA isolation protocol for the medicinal plant lemon balm （Melissa officinalis， Lamiaceae）[J].Genetics and Molecular Research，2012，11（2）：1049-1057.

[16] ATTITALLA I H.Modified CTAB method for high quality genomic DNA extraction from medicinal plants[J].Pakistan Journal of Biological Sciences，2011，14（21）：998-999.

[17] LOGEMANN J，SCHELL J，WILLMITZER L.Improved method for the isolation of RNA from plant tissues[J].Analytical Biochemistry，1987，163（1）：16-20.

[18] GHOLIZADEH M，KHOSRAVI A，TORABIAN P，et al.Association of the epidermal growth factor gene +61A/G polymorphism with hepatocellular carcinoma in an Iranian population[J].Gastroenterology and Hepatology from Bed to Bench，2017，10（4）：284-288.

[19] 程鵬飛，劉緒，余敏，等.酸堿“一步法”熒光PCR快速檢測乙型肝炎病毒核酸[J].中國生物制品學(xué)雜志，2015，28（12）：1297-1304.

[20] 高潔，嚴(yán)敏，付婷，等.免核酸提取法與煮沸裂解法對HBV-DNA提取后熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響比較[J].中外女性健康研究，2018（9）：1-2.

[21] 高源，申辛欣，馮志山，等.簡化核酸提取過程在病原體核酸檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].病毒學(xué)報(bào)，2020，37（2）：445-450.

[22]格林M R，薩姆布魯克J.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].4版.賀福初，譯.北京：科學(xué)出版社，2017.