龍佳麗，鄒 奕，邳 植，吳則東

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

低溫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常遇到的非生物脅迫，是限制作物產(chǎn)量和地理分布的主要環(huán)境因素之一[1]。低溫脅迫可引起植物膜通透性改變，破壞酶系統(tǒng)，引起代謝異常，減少能量供應(yīng)，抑制光合作用，促進(jìn)有毒物質(zhì)的積累[1]。在嚴(yán)重的情況下，低溫脅迫甚至可能導(dǎo)致植物死亡[1]。甜菜是世界上最重要的產(chǎn)糖作物之一，約占全球產(chǎn)糖量的30%[2-3]。在中國(guó)集中栽種在內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江等地[4]。甜菜種子萌發(fā)起始溫度為4～5℃，最適溫度為25℃[5]。當(dāng)甜菜種子或幼苗在早期發(fā)育階段暴露于冷凍溫度時(shí)，種子的發(fā)芽率、植株的存活率以及成熟植株的蔗糖產(chǎn)量均會(huì)受到低溫的嚴(yán)重限制[6]。甜菜幼苗凍害初期主要表現(xiàn)為葉片直硬，進(jìn)而呈水漬狀。溫度回升后，葉片萎蔫、退綠褐化，甚至變黑死亡。因此，研究低溫在甜菜生長(zhǎng)發(fā)育中的調(diào)節(jié)以提高甜菜低溫耐受性是非常有必要的。

植物激素作為一種信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)許多生長(zhǎng)發(fā)育代謝進(jìn)程，并在抵抗非生物脅迫中起著重要作用[7-8]。在低溫脅迫下，生長(zhǎng)素在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[9]。在擬南芥中，冷應(yīng)激同時(shí)影響生長(zhǎng)素的運(yùn)輸和信號(hào)傳遞過程，長(zhǎng)期冷應(yīng)激分別導(dǎo)致Aux/IAA和ARF蛋白家族的協(xié)調(diào)下調(diào)和上調(diào)[9]。脫落酸(ABA)常被稱為脅迫反應(yīng)激素，在根形態(tài)建成和非生物脅迫防御中起著關(guān)鍵作用[10-11]。當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ABA水平升高，進(jìn)而激活A(yù)BA介導(dǎo)的抗性途徑，從而促進(jìn)氣孔關(guān)閉，增強(qiáng)植物抗旱能力[12]。在水稻中，過表達(dá)ABA受體基因OsPYL10可以顯著增強(qiáng)秈稻的耐旱性與耐寒性[13]。在赤霉素(GA)信號(hào)途徑中，赤霉素受體蛋白GID1與GAs相互作用，降解DELLA蛋白，促進(jìn)GA反應(yīng)。而DELLA蛋白SLR1的編碼基因OsSLR1在低溫條件下被顯著上調(diào)，以抑制GA反應(yīng)[14]。此外，油菜素內(nèi)酯(BR)也是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的激素，通過激活細(xì)胞表面受體（BRI1和BAK1）激酶活性，并導(dǎo)致一種抑制BRI1的新蛋白BKI1的分離，進(jìn)而誘導(dǎo)BZR1和BZR2 2個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[15]。然而，這些植物激素在甜菜中如何參與低溫應(yīng)答仍未可知。

隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)植物耐低溫的分子機(jī)制進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果已成功的應(yīng)用于水稻[16]、玉米[17]、小麥[18]等植物的研究。為了進(jìn)一步探究甜菜對(duì)低溫應(yīng)答的分子機(jī)制，本研究對(duì)低溫處理后甜菜葉片轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行測(cè)定。利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析策略探索甜菜低溫應(yīng)答的分子機(jī)制，研究植物激素調(diào)控的信號(hào)通路是否參與甜菜低溫脅迫防御。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

本研究選用KWS9442作為材料，于2019年4月份在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)將種子播種于方形花盆(12 cm×12 cm×10 cm)。發(fā)芽后，于溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度為140 μmol/(m2s)，光周期14 h/10 h培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周。隨后，將幼苗轉(zhuǎn)移到4℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，光照條件保持不變。分別剪取低溫處理0、3、6、12、24、36、48 h后甜菜葉片，液氮速凍后-80℃冰箱保存。每個(gè)處理共設(shè)3次重復(fù)。使用TRIzol Reagent提取葉片總RNA。所有RNA樣品用于qRT-PCR分析，0 h和24 h RNA樣品還用于RNA-seq。

1.2 文庫構(gòu)建和RNA-seq

對(duì)RNA濃度、純度及完整性進(jìn)行檢測(cè)后，參照Illumina Truseq RNA sample prep Kit標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行文庫構(gòu)建。隨后，對(duì)文庫進(jìn)行定量和質(zhì)量檢測(cè)。最后，使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序。

1.3 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

對(duì)raw reads中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads進(jìn)行過濾后獲得clean reads，計(jì)算GC含量、Q20和Q30。使用HISAT2將clean reads比對(duì)到甜菜參考基因組RefBeet-1.2.2，并計(jì)算比對(duì)率。檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序飽和度評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)量是否滿足后續(xù)分析。采用Stringtie軟件計(jì)算每個(gè)基因在樣本中的FPKM值，根據(jù)樣本所有基因的FPKM值計(jì)算組內(nèi)及組間的Pearson相關(guān)性系數(shù)。通過比對(duì)NR、Swiss-Prot、Pfam、STRING、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋。

1.4 顯著地差異表達(dá)基因的篩選

采用DESeq方法篩選對(duì)照組與低溫處理組之間的DEGs。首先，對(duì)原始的基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。隨后，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)概率(P-value)的計(jì)算，并進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正獲得FDR值。以低溫處理組與對(duì)照組的表達(dá)量變化倍數(shù)大于2倍且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR值小于0.05為閾值篩選DEGs。

1.5 功能注釋與富集分析

為研究DEGs的生物功能和參與代謝途徑，將所有DEGs映射到GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路分析。

1.6 qRT-PCR驗(yàn)證

2個(gè)BvDREBs和12個(gè)參與脫落酸和生長(zhǎng)素信號(hào)通路的DEGs被挑選，檢測(cè)其在低溫應(yīng)答過程表達(dá)模式。qRT-PCR引物設(shè)計(jì)及定量方法參照Pi等[19]的方法，引物序列詳見表1。采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，中國(guó)大連）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，使用TB Green premix Ex Taq（TaKaRa，中國(guó)大連）試劑進(jìn)行熒光定量PCR。每個(gè)樣品3次重復(fù)，按2-ΔΔCT相對(duì)定量法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 本研究用于qRT-PCR的引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下BvDREBs表達(dá)模式分析

前期研究表明甜菜‘KWS9442’是低溫抗性較強(qiáng)的品種[20]。對(duì)生長(zhǎng)4周的甜菜幼苗進(jìn)行4℃低溫處理24 h后，甜菜表型并無萎蔫、葉斑、黃化等明顯變化。為確定甜菜對(duì)低溫的響應(yīng)過程，選擇植物低溫應(yīng)答中已知的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子BvDREBs作為標(biāo)記基因。BvDREBA1和BvDREBA4的表達(dá)水平在低溫過程中均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)（圖1）。BvDREBA1在低溫處理24 h后表現(xiàn)出顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)超過300倍。BvDREBA4基因表達(dá)水平在低溫處理24 h后達(dá)到峰值，上調(diào)倍數(shù)約為10倍。低溫處理36 h后，這些基因表達(dá)水平均隨著低溫持續(xù)逐步下調(diào)。BvDREBs受低溫誘導(dǎo)24 h后表達(dá)水平達(dá)到峰值，說明此時(shí)甜菜低溫應(yīng)答被激活。

圖1 低溫脅迫過程中BvDREBs表達(dá)模式

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得269609790原始讀數(shù)，去除低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads后獲得269237926過濾讀數(shù)（表2）。GC含量在43.60%～44.28%之間，Q20含量均在98.2%以上，Q30的值均在94.8%以上，測(cè)序錯(cuò)誤率均在0.03%以下。利用HISAT2軟件，將clean reads比對(duì)到甜菜參考基因組RefBeet-1.2.2上，比對(duì)率91.747%～92.098%（表2）。為評(píng)估不同測(cè)序量的條件下各基因的表達(dá)檢測(cè)是否準(zhǔn)確，對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了飽和度分析。結(jié)果顯示，各樣品中高(FPKM＞15)、中(0.6＜FPKM＜15)、低表達(dá)基因(FPKM＜0.6)飽和曲線均達(dá)到平臺(tái)期，說明本次測(cè)序的深度足夠。

表2 測(cè)序讀數(shù)比對(duì)到參考基因組的基本統(tǒng)計(jì)

為評(píng)估樣品之間的重現(xiàn)性，計(jì)算了各樣品的Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，對(duì)照組3個(gè)重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)在0.939～0.945之間，低溫處理組3個(gè)重復(fù)間相關(guān)系數(shù)在0.915～0.936之間，說明本次試驗(yàn)結(jié)果具有較好的重現(xiàn)性。此外，對(duì)照組與處理組樣品間相關(guān)系數(shù)在0.814～0.874之間。組間相關(guān)系數(shù)低于組內(nèi)相關(guān)系數(shù)，暗示24 h低溫處理引起部分蛋白發(fā)生變化。綜合以上質(zhì)控分析結(jié)果，測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足后續(xù)基因表達(dá)分析要求。

2.3 功能注釋與篩選DEGs

經(jīng)過比對(duì)參考基因組共鑒定基因27964個(gè)，分別檢索NR、Swiss-Prot、Pfam、STRING、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)基因功能進(jìn)行注釋。共有26720個(gè)基因功能被成功注釋，占全部基因的95.5%。為篩選甜菜中低溫應(yīng)答基因，使用DESeq軟件以基因變化倍數(shù)大于2倍且FDR小于0.05為閾值篩選DEGs。共獲得3061個(gè)DEGs，其中上調(diào)表達(dá)1363個(gè)、下調(diào)表達(dá)1698個(gè)（圖2）。

圖2 對(duì)照組與低溫處理組間DEGs火山圖

2.4 顯著地差異表達(dá)基因的功能注釋及富集

對(duì)鑒定到的DEGs進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，共有49個(gè)GO term被顯著富集，包括生物學(xué)過程22個(gè)GO term、分子功能13個(gè)GO term、細(xì)胞組分14個(gè)GO term。根據(jù)GO term富集顯著程度（FDR值）及有向無環(huán)圖中的上下級(jí)關(guān)系，挑選出12個(gè)與低溫應(yīng)答相關(guān)的GO term（圖3A）。在生物過程方面，激素響應(yīng)(GO:0009725)、含氧化合物響應(yīng)(GO:1901700)、酸性化合物響應(yīng)(GO:0001101)、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0009755)等方面被顯著富集。其中，激素響應(yīng)(GO:0009725)最顯著，F(xiàn)DR值為3.73×108。同時(shí)，激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0009755)也被顯著富集，F(xiàn)DR值為0.00014。在分子功能方面，DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(GO:0003700)和蛋白激酶活性(GO:0004672)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)GO terms被顯著富集。細(xì)胞組分方面富集結(jié)果反映出這些DEGs編碼蛋白主要分布于核小體(GO:0000786)、細(xì)胞周邊(GO:0071944)、細(xì)胞膜系統(tǒng)(GO:0016021和(GO:0031225)。說明激素調(diào)控的信號(hào)通路在低溫應(yīng)答中具有重要作用。

圖3 甜菜低溫處理DEGs的GO富集分析

對(duì)參與激素響應(yīng)(GO:0009725)和激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0009755)的DEGs進(jìn)一步分類（圖3B～C）發(fā)現(xiàn)，激素反應(yīng)(GO:0009725)總共包含233個(gè)DEGs，117個(gè)上調(diào)表達(dá)，116個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些DEGs所響應(yīng)的激素種類包括生長(zhǎng)素(auxin)、ABA、乙烯(ETH)、水楊酸(SA)、BR、GA、茉莉酸(JA)、細(xì)胞分裂素(CTK)。其中，ABA和auxin響應(yīng)基因最多，分別為65個(gè)和59個(gè)基因，占28%和25%。激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(GO:0009755)共涉及125個(gè)DEGs，包括59個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和66個(gè)下調(diào)表達(dá)基因。這些基因可分為8類，與激素響應(yīng)(GO:0009725)結(jié)果相似。其中，參與auxin和ABA介導(dǎo)的信號(hào)通路的基因最多，分別為51個(gè)和27個(gè)，占41%和22%。

2.5 DEGs的KEGG功能注釋及富集

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)DEGs參與的代謝通路進(jìn)行功能注釋，這些DEGs涉及293個(gè)代謝通路。其中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路、淀粉和糖代謝等8條通路被顯著富集。與GO富集結(jié)果一致，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075)富集程度最為顯著，F(xiàn)DR值為0.00017。該通路中DEGs主要參與auxin、ABA、ETH、GA、BR、CTK、JA 和 SA 信號(hào)通路（圖4）。其中，PP2C、PYL、ABF和SAPK2均受低溫處理影響轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化，它們編碼的蛋白相互作用參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Auxin信號(hào)通路中，編碼auxin響應(yīng)蛋白SAUR和IAA的基因也受低溫處理影響。此外，低溫脅迫還會(huì)導(dǎo)致編碼DELLA、JAZ、BZR等其他激素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的基因發(fā)生顯著變化。

圖4 參與植物激素信號(hào)通路的低溫應(yīng)答DEGs

2.6 熒光定量PCR分析DEGs

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，挑選2個(gè)BvDREBs和12個(gè)auxin和ABA響應(yīng)DEGs比對(duì)qRTPCR和RNA-seq定量結(jié)果。由圖5和圖6可知，2種方法檢測(cè)到的基因表達(dá)模式結(jié)果基本一致。RNA-seq同樣檢測(cè)到BvDREBA1和BvDREBA4在低溫處理24 h后表達(dá)量顯著上調(diào)，變化倍數(shù)分別為159倍和19倍。在auxin介導(dǎo)的信號(hào)通路中，分別挑選了3個(gè)SAUR和ABP19a進(jìn)行基因表達(dá)模式的測(cè)定。這些基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相符。BvSAUR21、BvSAUR50和BvSAUR64均在低溫處理3 h內(nèi)表現(xiàn)出顯著下調(diào)，變化倍數(shù)4.8～7.2倍，且在低溫處理48 h基因表達(dá)水平進(jìn)一步降低。3個(gè)BvABP19a基因則受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，基因水平在處理24 h后達(dá)到最大值，上調(diào)倍數(shù)超過20倍。在ABA響應(yīng)通路中，編碼ABA受體蛋白的PYL1和PYL8基因表達(dá)均受低溫處理顯著抑制，并且隨著低溫持續(xù)基因表達(dá)水平逐漸降低。然而，位于PYL下游的基因則對(duì)低溫處理表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。BVRB_1g008630和BVRB_6g138530均編碼蛋白激酶SAPK2，在低溫處理后12 h內(nèi)基因水平分別顯著下調(diào)8倍和上調(diào)2.9倍。相似地，BVRB_7g163980和BVRB_7g169340均編碼轉(zhuǎn)錄因子ABF2，低溫處理24 h后基因水平分別下調(diào)11.6倍和上調(diào)2.6倍。

圖5 qRT-PCR和RNA-seq檢測(cè)低溫脅迫過程中BvDREBs表達(dá)模式

圖6 qRT-PCR和RNA-seq分析低溫脅迫下參與auxin和ABA信號(hào)通路的DEGs表達(dá)模式

3 討論

CBF/DREB途徑是植物低溫應(yīng)答中保守的主效途徑[21]。AtDREBs受低溫誘導(dǎo)后，數(shù)小時(shí)內(nèi)表達(dá)量就會(huì)達(dá)到頂峰，并隨著低溫持續(xù)表達(dá)水平逐漸下調(diào)。通過對(duì)cbf突變體研究表明，AtDREBs參與Ca2+、激素信號(hào)、碳代謝等途徑基因的激活與抑制[22]。本研究結(jié)果表明，BvDREBs基因表達(dá)模式與擬南芥AtDREBs表達(dá)模式相似。低溫誘導(dǎo)24 h后表達(dá)量達(dá)到峰值，表明此時(shí)甜菜低溫應(yīng)答被激活。進(jìn)一步利用RNA-seq分析甜菜KWS9442品種在低溫處理前后的基因表達(dá)變化，從分子水平探究基因在調(diào)控甜菜低溫應(yīng)答具有的重要作用?；贒EGs表達(dá)變化、GO富集和KEGG功能富集發(fā)現(xiàn)，auxin和ABA等激素介導(dǎo)的信號(hào)通路是甜菜響應(yīng)低溫的重要方式。

Auxin主要在幼芽、幼葉、莖尖等具分生能力的組織中合成，作為植物必需的激素廣泛參與調(diào)控細(xì)胞分裂與大小、向光性、向地性等生長(zhǎng)和發(fā)育過程[23]。ABP是一種能夠在酸性條件下結(jié)合auxin的糖蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)膜上的auxin受體，調(diào)控細(xì)胞伸長(zhǎng)與分裂。過表達(dá)AtABP1或者外源施加ABP1純化蛋白和C-末端多肽均能激活auxin信號(hào)通路，增加葉片細(xì)胞大小[24]。相反，RNAi突變體細(xì)胞大小則顯著低于野生型[25]。在擬南芥中異源過表達(dá)OsABP57后，突變體在干旱脅迫和鹽脅迫條件下鮮重和根長(zhǎng)均顯著高于野生型[26]。而在水稻中原位過表達(dá)OsABP57可以顯著促進(jìn)水稻不定根形成，有助于水稻適應(yīng)澇害引起的根系缺氧[27]。本研究低溫處理3 h后，分別有3個(gè)和2個(gè)BvABP19a基因水平發(fā)生顯著上調(diào)和下調(diào)。這暗示低溫環(huán)境能夠影響甜菜auxin信號(hào)通路，從而調(diào)控植株生長(zhǎng)。此外，筆者檢測(cè)到16個(gè)BvSAUR基因表達(dá)受到低溫顯著抑制。SAUR作為最大的auxin早期應(yīng)答基因家族，可以與PP2Cs相互作用并抑制其磷酸酶活性，從而激活促進(jìn)細(xì)胞延伸，促進(jìn)葉片的擴(kuò)張和開放，增強(qiáng)下胚軸的伸長(zhǎng)[28]。過表達(dá)AtSAUR19、AtSAUR41等多個(gè)SAURs基因均能夠促進(jìn)細(xì)胞延伸生長(zhǎng)，使細(xì)胞大小出現(xiàn)顯著變化[29-30]。一些研究還表明SAURs還與非生物脅迫防御相關(guān)。過表達(dá)AtSAUR19基因會(huì)延緩氣孔關(guān)閉，加速葉片失水[29]。擬南芥中異源轉(zhuǎn)化TaSAUR78后，突變體對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性，葉片中活性氧積累較野生型更低[31]。本研究共發(fā)現(xiàn)16個(gè)BvSAUR在低溫處理后顯著下調(diào)，其中BvSAUR50、BvSAUR64、BvSAUR21等變化倍數(shù)超過40倍。此外，BvPID、BvBG、BvIAA等多個(gè)參與auxin信號(hào)通路的基因表達(dá)也在低溫處理后受到抑制。這些基因的顯著下調(diào)暗示低溫條件下auxin信號(hào)通路可能調(diào)控甜菜生長(zhǎng)以適應(yīng)低溫環(huán)境。

ABA常被稱為脅迫反應(yīng)激素，在根形態(tài)建成和非生物脅迫防御中起著關(guān)鍵作用[10-11]。通過對(duì)小麥[32]、水稻[33]、玉米[34]、葡萄[11]等的研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下外源ABA可以改變作物內(nèi)源激素水平，使內(nèi)源ABA含量增加，從而提高植物的抗寒性。這與低溫脅迫下外源ABA能夠提高甜菜抗氧化防護(hù)系統(tǒng)，從而增強(qiáng)甜菜抗逆性的研究結(jié)果一致[10]。PYR、PYL和RCAR家族成員被認(rèn)為是ABA的主要受體，與ABA結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生變化[35]。隨后，識(shí)別PP2Cs并抑制其去磷酸化活性，導(dǎo)致蛋白激酶SAPK2被磷酸化[36]。磷酸化的SAPK2激酶活性被激活，催化轉(zhuǎn)錄因子ABFs發(fā)生磷酸化修飾，激活A(yù)BFs轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)啟動(dòng)子區(qū)中含有ABRE元件的基因表達(dá)[37]。在水稻中，共有10個(gè)ABA信號(hào)通路基因在低溫處理后表現(xiàn)出顯著變化。其中，除1個(gè)PYR/PYL同源基因下調(diào)表達(dá)外，5個(gè)PP2C、2個(gè)SnRK2以及2個(gè)ABF同源基因均上調(diào)表達(dá)[38]。在胡蘿卜中，ABF1基因同樣受低溫誘導(dǎo)，表達(dá)水平在低溫處理24 h時(shí)達(dá)到峰值，上調(diào)5.47倍[39]。而在牛皮杜鵑中，12個(gè)PP2Cs基因在低溫處理后表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。同時(shí)，5個(gè)SnRK2s基因在低溫處理后顯著上調(diào)，1個(gè)表現(xiàn)出下調(diào)模式[40]。與這些結(jié)果相似，BvPYL、BvSAPK2、BvPP2C、BvABF基因表達(dá)水平均受到低溫顯著影響，說明ABA信號(hào)通路是甜菜響應(yīng)低溫脅迫的主要信號(hào)通路之一。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)這些基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)并不一致。如在2個(gè)低溫應(yīng)答的BvSAPK2中，BVRB_1g008630在低溫處理后基因表達(dá)受到顯著抑制，而BVRB_6g138530基因表達(dá)水平則顯著升高。相似地，2個(gè)BvABF2基因分別在低溫處理后表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)甜菜中可能存在由不同同源基因構(gòu)成的多個(gè)ABA信號(hào)通路，甜菜通過激活與抑制不同ABA信號(hào)通路激活低溫脅迫防御。這些不同ABA信號(hào)通路在甜菜生長(zhǎng)發(fā)育與低溫脅迫防御中具體調(diào)控哪些生物過程仍值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)低溫處理前后甜菜轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行分析，鑒定到3061個(gè)低溫應(yīng)答的DEGs。對(duì)這些DEGs功能富集發(fā)現(xiàn)，激素介導(dǎo)的信號(hào)通路在甜菜低溫應(yīng)答中具有重要作用。其中，auxin和ABA信號(hào)通路與低溫脅迫密切相關(guān)。在auxin信號(hào)通路中DEGs主要為BvABP19a和BvSAUR，而在ABA信號(hào)通路中BvPYL、BvSAPK2、BvABF響應(yīng)低溫脅迫。這些基因?qū)μ鸩说蜏孛{迫防御的調(diào)控作用值得進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步解析甜菜響應(yīng)低溫脅迫的分子機(jī)制提供重要信息。