張海峰，劉 赫，郭傳祺，馬春泉

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

天然橡膠(NR，natural rubber)是天然高分子化合物，在工業(yè)、國防等領(lǐng)域有著重要戰(zhàn)略意義，發(fā)展NR產(chǎn)業(yè)是中國戰(zhàn)略性橡膠資源儲備的重要支柱之一。除巴西橡膠樹外，橡膠草、杜仲、銀膠菊、萵苣等植物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)可作為潛在的產(chǎn)膠替代植物[1]，隨著研究的逐漸深入，各種產(chǎn)膠植物通過甲羥戊酸(MVA)和甲基赤蘚糖醇(MEP)途徑共同合成天然橡膠，NR合成機制逐漸明晰，其合成途徑中關(guān)鍵的調(diào)控基因和關(guān)鍵酶被揭示，為NR的生物合成提供了重要基礎(chǔ)。本研究對近年來產(chǎn)膠植物的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等不同維度的研究進展進行了系統(tǒng)的梳理和總結(jié)，以期為后續(xù)組學(xué)技術(shù)聯(lián)合解析深入挖掘產(chǎn)膠植物中NR合成的重要基因和蛋白質(zhì)以及完善NR合成分子機制提供借鑒和參考。

1 產(chǎn)膠植物基因組學(xué)研究

1.1 巴西橡膠樹基因組研究

巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)是大戟科橡膠樹屬植物，是目前橡膠樹中產(chǎn)膠能力最強的品種，是NR的主要來源，因而通過反向遺傳學(xué)研究來提高NR含量的策略具有重要意義。2002年張桂和等[2]采用改良CTAB法提取巴西橡膠樹幼嫩葉片總DNA，并構(gòu)建了基因組文庫，從而開始了巴西橡膠樹分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究。Rahman等[3]采用全基因組鳥槍法對巴西橡膠樹高產(chǎn)無性系RRIM600進行基因組測序，報道了巴西橡膠樹的基因組草圖，預(yù)測共包含了68955個基因。2016年Tang等[4]進一步對巴西橡膠樹全基因組進行精細化測序，覆蓋率達93.8%，獲得高質(zhì)量的基因組序列1.37 Gb；同時鑒定了橡膠生物合成的關(guān)鍵基因REF1，為功能基因組學(xué)和優(yōu)良橡膠樹品種育種提供了寶貴的資源。2020年Liu等[5]使用單分子實時測序(SMRT)和三維基因組(HiC)技術(shù)建立了橡膠樹品種GT1參考基因組，該基因組為1.47 Gb，與共同祖先的其他植物相比，發(fā)現(xiàn)在橡膠樹GT1中與橡膠生物合成過程相關(guān)的基因大量擴張，為今后橡膠樹GT-1提高NR含量以及NR合成相關(guān)基因的深入研究提供了新的依據(jù)。巴西橡膠樹基因組的測序或重測序的工作逐步深入，為尋找提高巴西橡膠樹的產(chǎn)膠量、抗逆性等重要生物性狀的基因奠定基礎(chǔ)。Ding等[6]通過橡膠生物合成基因的共表達網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)了橡膠小顆粒蛋白(SRPP，small rubber particle protein)、橡膠延伸因子(REF，rubber elongation factor)和順式戊烯基轉(zhuǎn)移酶(CPT，cis-isoprene transferase)是參與NR生物合成的樞紐基因。同時Karine等[7]發(fā)現(xiàn)膠乳中REF基因表達的蛋白含量與橡膠含量呈正比。2018年Retno等[8]發(fā)現(xiàn)過表達HbERF-IXc5的轉(zhuǎn)基因巴西橡膠樹在組織學(xué)水平上積累了更多的淀粉，分化了更多的乳膠細胞，提高了產(chǎn)膠含量。這些信息的發(fā)現(xiàn)為進一步發(fā)掘橡膠樹產(chǎn)膠途徑中優(yōu)質(zhì)基因資源奠定重要基礎(chǔ)。挖掘更多產(chǎn)膠量高、抗逆性強的優(yōu)良基因并轉(zhuǎn)入巴西橡膠樹以提高NA含量尤為重要。

1.2 橡膠草基因組研究

NR需求的激增和巴西橡膠樹受病蟲害及生長環(huán)境限制等因素，致使NR行業(yè)面臨著嚴峻考驗，因此尋求巴西橡膠樹替代產(chǎn)膠植物迫在眉睫。橡膠草(Taraxacum kok-saghyz)是菊科蒲公英屬多年生草本植物，因其根部含有的橡膠膠質(zhì)與巴西橡膠樹橡膠成分最為相似，且具有生長收獲期短、種植地域廣泛、經(jīng)濟收益可觀的優(yōu)勢，可作為優(yōu)良的產(chǎn)膠替代植物。Lin等[9]運用SMRT組裝完成了高質(zhì)量的橡膠草基因組草圖，為NR產(chǎn)膠相關(guān)基因的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

橡膠草基因組草圖的公布極大地降低了克隆獲得NR生物合成關(guān)鍵基因的難度，對深入挖掘橡膠草基因功能十分重要。2009年Wahler[10]利用基因沉默技術(shù)沉默引起橡膠草膠乳褐變的多酚氧化酶(PPO)基因，發(fā)現(xiàn)該基因沉默后橡膠草的產(chǎn)膠量增加4～5倍。Wieghaus等[11]通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了橡膠草抑制根生長基因TkRALF，發(fā)現(xiàn)敲除該基因后橡膠草更容易形成主根，提高NR產(chǎn)量。趙麗娟等[12]在研究巴西橡膠樹產(chǎn)膠基因REF的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)在橡膠草中過表達REF基因能有效地提高NR產(chǎn)量。張慧艷等[13]從橡膠草中克隆獲得橡膠合成相關(guān)的TkSRPP3基因，發(fā)現(xiàn)該基因過表達橡膠草的根部相對野生型較粗壯，根尖有膨大現(xiàn)象，根部生物量增加，利于提高橡膠產(chǎn)量。同時，橡膠草在應(yīng)對逆境過程中也表現(xiàn)出許多優(yōu)良性狀，王肖肖等[14]在橡膠草中克隆得到了一個E2泛素結(jié)合酶基因TkUBC2，該基因在鹽脅迫和紫外輻射處理下上調(diào)表達，在干旱脅迫、滲透脅迫條件下則下調(diào)表達。江羽宸等[15]以野生型橡膠草為材料，發(fā)現(xiàn)3月齡橡膠草在鹽脅迫處理6 h時TkJAZ9基因表達量上調(diào)2.16倍，表明該基因參與橡膠草應(yīng)答鹽脅迫。

1.3 杜仲基因組研究

杜仲(Eucommia ulmoides)屬于杜仲科杜仲屬植物，是中國特有的名貴經(jīng)濟樹種，其外果皮、樹皮和樹葉內(nèi)均含有反式-1,4-聚異戊二烯橡膠，該橡膠與巴西橡膠樹橡膠為同分異構(gòu)體[16]，由于其耐嚴寒，在中國大部地區(qū)均可栽培，適應(yīng)性很強，近年來也開始用作替代NR合成的優(yōu)良植物。Wuyun[17]使用Illumina測序、PacBio測序和Bionano作圖相結(jié)合的策略獲得杜仲1.2 Gb的高質(zhì)量組裝基因組，預(yù)測其基因組含有26723個基因，在此基礎(chǔ)上Tokumoto等[18]對不同樣本中的杜仲基因進行了全基因組分析，發(fā)現(xiàn)27個參與NR生物合成的關(guān)鍵基因，其中包括編碼MVA和MEP途徑的酶基因，反式-1,4-聚異戊二烯合成酶(TIDS，transisoprenyl diphosphate synthase)基 因 (GPS、FPS和GGPS)、和其他與NR合成相關(guān)的基因，并且TIDS基因的表達受到這2個途徑的影響。說明杜仲通過MEP和MVA 2個途徑及途徑外的多種基因共同調(diào)節(jié)NR合成。Suzuki等[19]分別通過對杜仲內(nèi)、外莖的EST文庫測序，分離出6個參與MVA途徑的FPS基因，并通過對酵母突變體的功能互補證實了它們在異戊烯基二磷酸(IPP)生物合成中的作用，促進NR的生物合成。此外，劉慧敏[20]利用啟動子元件分析篩選出杜仲NR生物合成關(guān)鍵基因FPS5表達調(diào)控相關(guān)的lncRNA和miRNA，構(gòu)建了杜仲NR合成關(guān)鍵基因的調(diào)控系統(tǒng)，為提高杜仲NR含量提供了重要的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1.4 其他產(chǎn)膠植物基因組研究

為緩解NR日益累增的消耗問題，除巴西橡膠樹、橡膠草、杜仲等產(chǎn)膠植物外，科學(xué)家們一直致力于拓寬產(chǎn)膠替代植物的范疇，銀膠菊(Parthenium argentatum)和萵苣(Lactuca sativa)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)膠特性，對于緩解NR消耗壓力具有重大意義。

銀膠菊屬于菊科銀膠菊屬，其所含的NR與巴西橡膠樹的NR結(jié)構(gòu)和性能類似，但其全基因組序列尚未測序完成，對銀膠菊的基因組學(xué)研究有望使其成為有替代潛力的產(chǎn)膠植物[21]。2019年Lakusta等[22]鑒定了銀膠菊中3個PaCPT(PaCPT1-3)基因和1個PaCBP基因，發(fā)現(xiàn)這2類基因主要在莖中表達，并受低溫脅迫誘導(dǎo)，同時參與NR的生物合成。2017年Reyes等[23]使用基因組測序和Illumina測序，獲得了第一個基因組大小約為2.5 Gb的高質(zhì)量萵苣參考基因組。目前銀膠菊和萵苣NR合成相關(guān)基因的研究報道相對較少，在功能基因組研究和產(chǎn)膠能力提升等方面仍有較大空間。綜上所述，對產(chǎn)膠植物的研究結(jié)果表明，除了MVA和MEP的產(chǎn)膠途徑關(guān)鍵基因外，還有很多基因能夠提高天然橡膠含量（表1），為補充產(chǎn)膠基因與解析基因功能研究奠定了基礎(chǔ)?；蚪M學(xué)研究促進了對產(chǎn)膠植物復(fù)雜產(chǎn)膠生物系統(tǒng)的理解，從基因水平上解釋了產(chǎn)膠途徑中各個環(huán)節(jié)重要基因的分子功能，為未來巴西橡膠樹更多產(chǎn)膠基因的發(fā)現(xiàn)提供了寶貴的基因組資源。

表1 產(chǎn)膠植物不同組織來源的NR合成途徑（MVA和MEP）以外的關(guān)鍵基因

2 產(chǎn)膠植物的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)不僅可以從整體水平上反映組織中基因的表達情況，而且可以預(yù)測新基因、解讀基因功能元件[28]。目前RNA-seq、EST及DNA微陣列等轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)在產(chǎn)膠植物研究中廣泛應(yīng)用，特別是在產(chǎn)膠途徑和逆境脅迫的研究中日漸深入。

2.1 產(chǎn)膠轉(zhuǎn)錄組研究

2014年Mantello[29]采用Illumina平臺對巴西橡膠樹樹皮進行RNA測序，通過GO、KEGG進行注釋共檢測到17927個SSRs和404114個SNPs。SNP標(biāo)記驗證參與橡膠生物合成的36個基因型，共檢測到78個SNPs。2019年甘霖等[30]利用已公布的橡膠草75868條轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，檢索并分析了橡膠草SSR序列信息，從RNA水平上揭示了橡膠草SSR分布規(guī)律和特性，為橡膠草遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因定位和克隆提供有效分子標(biāo)記。Chow等[31]利用RNA-Seq對膠乳進行測序，獲得了3441個特異的轉(zhuǎn)錄本，其中REF和SRPP在膠乳中含量最豐富。2015年Nie等[24]以巴西橡膠樹為材料，對ATP結(jié)合盒(ABC，ATP-binding cassette)蛋白基因進行了轉(zhuǎn)錄組測序和ABC蛋白基因的表達分析，在膠乳中共鑒定出46個ABC家族蛋白，進一步通過RTPCR驗證發(fā)現(xiàn)HbABCB15、HbABCB19、HbABCD1和HbABCG21的基因表達與NR生物合成密切相關(guān)，為進一步研究ABC在膠乳代謝和NR生物合成中的作用奠定了基礎(chǔ)。

2.2 逆境轉(zhuǎn)錄組研究

提升產(chǎn)膠植物抗逆水平是提高產(chǎn)膠植物NR含量的重要手段之一，例如乙烯處理巴西橡膠樹樹皮已經(jīng)成為增加乳膠產(chǎn)量的一種常規(guī)措施。安澤偉等[32]以巴西橡膠樹11個抗寒無性系和12個不抗寒無性系為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組cDNA-AFLP技術(shù)對巴西橡膠樹低溫處理前后的基因表達譜進行差異分析，發(fā)現(xiàn)差異表達的基因在逆境脅迫下大量表達，從而響應(yīng)低溫脅迫。莊玉粉[33]對乙烯處理8 h和24 h的巴西橡膠樹樹皮進行轉(zhuǎn)錄組從頭測序和組裝，分別檢測到了10216個和9374個差異表達基因，其中糖酵解途徑中的PFK、FBA、PGM等關(guān)鍵酶基因顯著上調(diào)，使糖酵解途徑加速運行提供充足的NR合成前體，促進NR的生物合成。王建霄[34]采用RNA-seq對橡膠樹進行轉(zhuǎn)錄組測序共組裝產(chǎn)生167911個Unigenes，低溫處理時發(fā)現(xiàn)2403個Unigenes上調(diào)表達，經(jīng)巴西橡膠樹參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋發(fā)現(xiàn)，與生長、應(yīng)激、抗氧化活性相關(guān)的基因在低溫脅迫后顯著上調(diào)表達。Wu等[35]對巴西橡膠樹9個與膠乳代謝相關(guān)的主要基因進行轉(zhuǎn)錄水平研究，發(fā)現(xiàn)這些基因上調(diào)表達與巴西橡膠樹膠乳代謝脅迫下的產(chǎn)膠有關(guān)，許多逆境特異基因的表達模式與產(chǎn)膠植物的NR含量密切相關(guān)（表2）。這些結(jié)果為產(chǎn)膠植物應(yīng)答逆境脅迫以及如何提高逆境下NR產(chǎn)量的研究奠定了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)培育抗逆產(chǎn)膠植物資源提供了重要參考價值。

表2 產(chǎn)膠植物響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)鍵基因

3 產(chǎn)膠植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)研究是基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的有效補充，不僅可以進行蛋白質(zhì)表達水平的測定，而且可以研究蛋白質(zhì)的相互作用，進而提供有關(guān)基因表達和調(diào)控的重要信息。目前關(guān)于產(chǎn)膠植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要集中在膠乳、橡膠粒子產(chǎn)膠與抗逆等方面。

3.1 產(chǎn)膠蛋白質(zhì)組學(xué)

作為產(chǎn)膠植物中的模式材料，圍繞巴西橡膠樹產(chǎn)膠主題進行了大量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。Wang等[40]從巴西橡膠樹不同組織成分中提取蛋白質(zhì)，采用雙向凝膠電泳(2-DE)結(jié)合熒光差異凝膠電泳分析(DIGE)技術(shù)進行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，首創(chuàng)巴西橡膠樹全蛋白凝膠圖譜。Tong等[41]通過2-DE凝膠電泳對膠乳的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)多種REF/SRPP家族蛋白質(zhì)，而且REF/SRPP家族蛋白質(zhì)在高膠乳的巴西橡膠樹中顯著表達，這一發(fā)現(xiàn)為探究NR生物合成提供重要信息。Wang等[42]對橡膠顆粒(RP)提取NR產(chǎn)生的洗滌液進行質(zhì)譜分析，鑒定到233個高豐度表達的蛋白質(zhì)，對RP膜蛋白在NR生物合成中的作用提供了新的證據(jù)。利用DIGE結(jié)合iTRAQ技術(shù)對乙烯刺激下的RP膜上不同的橡膠顆粒進行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)REF和SRPP異構(gòu)體的磷酸化修飾是NR生物合成的關(guān)鍵[43]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)和比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法，全面研究RP膜蛋白和膠乳蛋白中響應(yīng)乙烯脅迫的差異表達蛋白，有利于揭示NR生物合成及其調(diào)控的分子機制。2019年Xie等[44]通過2-DE凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)在橡膠草根部鑒定出58個包括10個REF/SRPP家族中參與MVA和MEP途徑的蛋白質(zhì)，繪制了第一張高分辨率橡膠草根部蛋白質(zhì)圖譜，為進一步填補橡膠草合成NR的相關(guān)蛋白提供了新的依據(jù)。在其他產(chǎn)膠植物中，目前還未見蛋白質(zhì)組學(xué)的報道。

3.2 抗逆蛋白質(zhì)組學(xué)

生物和非生物脅迫對產(chǎn)膠植物造成了極大影響，全面了解脅迫下的蛋白質(zhì)組變化有利于解決脅迫對產(chǎn)膠植物的危害，提高NR含量。目前關(guān)于巴西橡膠樹抗逆蛋白質(zhì)組學(xué)研究報道較多，而對于其他產(chǎn)膠植物的相關(guān)研究則比較少。由于巴西橡膠樹種植于熱帶地區(qū)，干旱是影響其生長的重要脅迫因素之一，巴西橡膠樹葉片在干旱脅迫下蛋白質(zhì)產(chǎn)生的質(zhì)或量變化，為了解巴西橡膠樹響應(yīng)干旱脅迫的分子基礎(chǔ)提供了理論指導(dǎo)[45]。Mohsen等[46]通過質(zhì)譜分析在巴西橡膠樹中鑒定出57種蛋白質(zhì)，其中氧化還原蛋白與干旱脅迫高度相關(guān)，為培育巴西橡膠樹抗旱種質(zhì)提供了依據(jù)。同樣，乙烯脅迫也會促進多種蛋白合成，加速NR分子合成。王帆[47]采用非標(biāo)記定量技術(shù)(LFQ，label free quantitative technology)對乙烯脅迫后巴西橡膠樹的樹皮差異表達蛋白進行了定量分析，從蛋白質(zhì)組水平上揭示乙烯脅迫促進NR增產(chǎn)的分子機制。Wang等[48]又進行乙烯脅迫下膠乳的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定到287個高豐度的蛋白質(zhì)以及143個乙烯響應(yīng)膠乳蛋白，膠乳蛋白主要參與翻譯后修飾、碳水化合物代謝、延長乳膠流動等，與NR生物合成密切相關(guān)。曹志遠[49]運用iTRAQ分析了巴西橡膠樹紅根病菌(Ganoderma pseudoferreum)脅迫下差異表達蛋白質(zhì)，并進行了功能和代謝通路的注釋，為巴西橡膠樹病菌防治和提高NR含量奠定了理論基礎(chǔ)。

產(chǎn)膠植物在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究下誘導(dǎo)出一系列與產(chǎn)膠途徑和抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)，對RP膜蛋白、逆境脅迫的研究使橡膠產(chǎn)出過程清晰地呈現(xiàn)出來，進而使用iTRAQ等技術(shù)進行定量研究，以期從蛋白質(zhì)角度闡明產(chǎn)膠植物抗逆以提高NR生物合成的分子機制，這些研究展示了如何使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，探索膠乳位置、合成途徑、代謝過程、環(huán)境脅迫等生物學(xué)過程中的產(chǎn)膠機制，使未來在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)下開拓更多產(chǎn)膠相關(guān)的優(yōu)良蛋白成為可能。

4 總結(jié)與展望

組學(xué)時代的到來，為產(chǎn)膠植物的深入相關(guān)研究提供了良好的思路，為解決NR需求的日益增加以及NR產(chǎn)量偏低等問題提供了重要研究方向。圖1是作者根據(jù)國內(nèi)外各組學(xué)在產(chǎn)膠植物中最新研究進展所總結(jié)的，從圖中可以看出產(chǎn)膠植物在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域發(fā)展日漸深入，而其他組學(xué)中的研究初露端倪，未來整合多組學(xué)對產(chǎn)膠植物的評價將會更加客觀和具體，且擁有更廣闊的應(yīng)用前景和科研價值。產(chǎn)膠植物生長過程中所附加的代謝產(chǎn)物菊糖和黃酮類化合物等能夠有效提高產(chǎn)膠植物的經(jīng)濟效益，具有較大的研究價值，因而代謝組學(xué)的研究勢在必行。修飾組學(xué)以探究蛋白質(zhì)翻譯后修飾對生命活動產(chǎn)生的影響為目標(biāo)，在未來研究產(chǎn)膠蛋白靶點的鑒定、產(chǎn)膠途徑標(biāo)志物的篩選等方面具有重要意義。而當(dāng)前興起的單細胞測序技術(shù)不僅可以研究單個細胞內(nèi)的基因表達情況，同時可以解決基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究中不同組織樣本測序時無法解決的細胞異質(zhì)性難題，使解析單個細胞的行為、機制成為了可能，未來將在產(chǎn)膠植物，特別是膠乳細胞中的深入研究發(fā)揮不可替代的作用。因此，增加代謝過程產(chǎn)能、鑒定產(chǎn)膠蛋白靶點、單個細胞定位產(chǎn)膠基因，培育抗逆性強、高產(chǎn)膠、代謝產(chǎn)物附加值大的產(chǎn)膠植物將成為產(chǎn)膠植物新的研究熱點。

圖1 產(chǎn)膠植物的多組學(xué)研究現(xiàn)狀與未來