李鈺飛,許俊香,劉本生,孫欽平,李吉進,劉建斌,郎乾乾,孫仁華,靳紅燕

(1.北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所 北京 100097;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護總站 北京 100125;3.中國城市建設研究院有限公司西北分院 北京 100120)

20世紀80年代以來,我國規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)得到了快速發(fā)展,同時伴隨著畜禽糞便的大量產(chǎn)生,極大增加了面源污染風險[1]。沼氣工程通過厭氧發(fā)酵工藝處置養(yǎng)殖廢棄物,使得環(huán)境污染得到了有效改善[2]。與此同時,產(chǎn)生的副產(chǎn)物沼液含有豐富的養(yǎng)分和微量元素,還可作為土壤改良劑或有機肥料應用于種植業(yè)[3]。大量研究證實,合理施用沼液有利于改善土壤理化性狀[4-6],提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[7-8],防控作物土傳病害[3,9-10]。

雞糞、豬糞和牛糞是沼氣工程常用的發(fā)酵原料,不同種類的畜禽糞便特性存在明顯差異。例如雞糞各種養(yǎng)分含量均較高,含有大量易分解有機物[11],養(yǎng)分釋放快,其主要作用是提高或維持作物產(chǎn)量;牛糞相對來說養(yǎng)分較低,但碳氮比高,有研究表明長期施用牛糞可以改善土壤物理性狀[12-13];Hafez[14]發(fā)現(xiàn)牛糞比雞糞更有利于降低土壤容重。不同種類畜禽糞便經(jīng)沼氣發(fā)酵后碳氮比均會降低[15],但依然在一定程度上保持著差別[16]。例如趙鳳蓮等[17]的盆栽試驗證實雞糞沼肥要比牛糞沼肥增產(chǎn)明顯,而后者的養(yǎng)分釋放較為緩慢。由此可見,不同來源的沼液進入土壤后對地下生態(tài)過程產(chǎn)生的影響也勢必存在差異。

土壤生物是地下生態(tài)過程的執(zhí)行者[18],其中土壤微生物是土壤生物類群的重要組成部分。作為食物網(wǎng)中的分解者[19],其占據(jù)食物網(wǎng)80%以上的生物量[20],參與土壤有機質(zhì)的分解與合成、養(yǎng)分的固定與釋放以及污染物的降解等過程,并且與土壤團聚體的形成密切相關[21]。土壤擾動會導致微生物群落結構、代謝特征和功能多樣性的變化,反過來這些也可作為土壤質(zhì)量評價的重要指標[22]。針對土壤微生物群落對沼液施用的響應,已有不少學者從不同角度開展了研究,例如沼液肥與其他肥料的對比[15,23],不同的沼液用量[2,24],沼液與其他材料配施[25-26],但尚少見不同發(fā)酵原料產(chǎn)生的沼液對土壤微生物群落影響的報導。

基于以上的研究背景,本研究將通過室內(nèi)培養(yǎng)試驗,對比雞糞、牛糞和豬糞3 種常見來源的沼液加入土壤后的土壤微生物碳代謝特征,并結合土壤理化指標和微生物生物量碳氮指標闡明不同來源沼液引發(fā)短期的土壤微生物群落變化的差異,為沼液的資源化利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤及樣品采集

本研究為室內(nèi)培養(yǎng)試驗,在北京市農(nóng)林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所溫室內(nèi)進行。試供土壤采集自北京市大興區(qū)北京青圃有機農(nóng)業(yè)專業(yè)合作社溫室,

土壤基礎理化性狀為:有機質(zhì)19.7 g·kg?1,全氮1.2 g·kg?1,速效磷72.7 mg·kg?1,有效鉀194.9 mg·kg?1,pH 8.20,電導率107.7 μS·cm?1。選取1 m2作為采樣樣方,用鐵鏟挖取表層0～20 cm 土壤帶回實驗室,并于1 周內(nèi)完成試驗布置。沼液來源于大興區(qū)不同的沼氣站,其中雞糞沼液采集自留民營沼氣站,牛糞沼液源自于趙莊子鎮(zhèn)沼氣站,豬糞沼液取自北蒲州沼氣站。3 種沼液均為厭氧發(fā)酵罐當天的流出液,取回后于4 ℃冰箱保存,理化性質(zhì)見表1。

表1 不同來源沼液的化學性狀Table 1 Chemical properties of different biogas slurry

1.2 試驗布置

試驗設置4 個處理:雞糞源沼液(FS)、豬糞源沼液(PS)、牛糞源沼液(CS)和對照(CK),每個處理3次重復,隨機區(qū)組排列。沼液添加量依據(jù)等氮原則(0.17 g·kg?1鮮土),不同處理稀釋成等體積的沼液加入土壤,對照處理以等量的蒸餾水代替。試驗所用盆為寬8 cm、高10 cm 的方形盆,每盆加入過2 mm篩的土壤450 g,然后加稀釋后沼液100 mL,避光培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,每隔3 d 按等重法補充水分。所有樣本于60 d 后取樣,一部分土樣置于4 ℃冰箱冷藏用于測定微生物量碳氮和微生物碳代謝,剩余部分風干處理用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.3 土壤化學性質(zhì)分析

土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮以1 mol·L?1NaCl 浸提后用流動分析儀測定,有機質(zhì)含量測定方法為重鉻酸鉀氧化法,全氮含量采用凱式蒸餾法測定,有效磷含量采用NaHCO3提取鉬銻抗比色法測定,速效鉀含量測定方法為乙酸銨浸提-火焰光度法,pH 采用pH 計測定(水土比2.5∶1),電導率用電導儀測定(水土比5∶1)[27]。

1.4 土壤微生物分析

土壤微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定,轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.45[28]。微生物群落評價采用基于微生物碳代謝功能的BIOLOG 微平板培養(yǎng)法測定。參考林先貴[29]的方法,取鮮土10 g 加入三角瓶中,于渦旋震蕩儀上震蕩2 min。吸取1 mL 液體于小試管中,震蕩30 s,吸取小試管中土壤懸濁液3 mL 轉(zhuǎn)移至離心管中,震蕩20 s,再轉(zhuǎn)移至V 型槽中,用八道移液槍向BIOLOG 板每孔加入150 μL 液體,置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。前2日每隔12 h 用酶標儀測定吸光度,從第3日起每隔24 h 測定吸光度(590 nm),總計培養(yǎng)7 d。采用平均吸光度(AWCD)、Shannon 豐富度指數(shù)(H′)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)(1/D)和McIntosh 均一度指數(shù)(U)來評價微生物群落。

式中:Ci為各孔的吸光值,R為對照孔的吸光值,當Ci?R為負數(shù)時記為零[29]。

式中:pi為第i孔相對吸光度與整板平均相對吸光度總和的比率。

式中:ni是第i孔的相對吸光度(Ci?R),N是相對吸光度總和,Simpson 指數(shù)用1/D表示[30]。

式中:ni是第i孔的相對吸光度(Ci?R)。

1.5 統(tǒng)計分析

采用單因素方差分析比較土壤化學指標和微生物指標在不同處理間的差異,多重比較方法為LSD,設置顯著性水平為P<0.05。方差分析前先進行齊次性檢驗,對于不滿足齊次性假設的數(shù)據(jù)進行對數(shù),開平方或反正弦轉(zhuǎn)換;若仍不滿足要求,則采取非參數(shù)檢驗方法(Kruskal-Wallis),并用Mann-Whitney 兩兩比較處理間的差異。所有統(tǒng)計分析在SPSS 16.0 中完成。

采用主成分分析(PCA)呈現(xiàn)處理間微生物群落的差異,分析前微生物碳代謝數(shù)據(jù)進行l(wèi)n(10 000x+1)轉(zhuǎn)換。分析在Canoco 5.0 中完成。

2 結果與分析

2.1 不同來源沼液對土壤理化性狀的影響

添加不同來源的沼液對土壤有機質(zhì)含量無顯著影響,但對其他土壤養(yǎng)分總體表現(xiàn)出不同程度的促進作用(表2)。與對照相比,沼液對土壤硝態(tài)氮含量的增加效果表現(xiàn)為豬糞沼液>雞糞沼液>牛糞沼液(P<0.05);對于土壤銨態(tài)氮含量,豬糞沼液處理顯著高于牛糞沼液處理(P<0.05),而各沼液與對照處理并無顯著差異;與此同時,不同沼液均顯著提高了土壤全氮含量(P<0.05)。各處理中有效磷含量最高的是雞糞沼液處理,有效鉀最高的是豬糞沼液處理,而這兩個指標在對照土壤中均最低。此外,施用沼液后各處理的pH 和電導率值也均有不同程度升高。

表2 不同來源沼液對土壤理化性狀的影響Table 2 Effects of different biogas slurry on soil physical and chemical properties

2.2 不同來源沼液對微生物量碳氮的影響

經(jīng)過60 d 的培養(yǎng),牛糞沼液處理獲得了最高的微生物生物量碳,顯著高于豬糞沼液(P<0.05)(圖1),但與對照和雞糞沼液處理相比并無顯著差異,而添加豬糞沼液則顯著降低了微生物生物量碳(P<0.05),但其同雞糞沼液的結果相比并無顯著差異。微生物生物量氮在不同處理間盡管存在差別,但并未達顯著差異水平。

2.3 不同來源沼液對土壤微生物碳源利用的影響

如圖2所示,各土壤樣品的孔平均顏色變化率隨著培養(yǎng)時間而逐漸升高,在48 h 之前不同處理間的差異尚不明顯,從72 h 開始變化規(guī)律逐漸明朗,主要表現(xiàn)在雞糞沼液可引發(fā)微生物最高的碳源利用強度,牛糞沼液與對照處理較為接近,而豬糞沼液有抑制微生物碳源利用的趨勢。

圖3 展示了土壤微生物對六大類碳源的利用情況。微生物對碳水化合物(Car)的利用在雞糞沼液處理中最高,顯著高于豬糞沼液(P<0.05),而處于二者之間的對照和牛糞沼液處理則均與其他處理無顯著差異。對于氨基酸(Ama),添加不同源沼液均有抑制微生物利用碳源的趨勢,但僅在豬糞沼液處理中達顯著水平(P<0.05),而后者與雞糞和牛糞處理也無顯著差異。雞糞沼液相比其他處理顯著促進了微生物對羧酸(Caa)的利用(P<0.05),這個指標在牛糞、豬糞和對照處理間并無顯著差異。不同處理土壤微生物對胺類(Ami)的利用程度也可劃分為3 個層次,雞糞沼液起到了促進作用,孔顏色變化率顯著高于處于第3 層次的對照和豬糞沼液(P<0.05),而后兩者并無顯著差異,處于中間層次的牛糞沼液處理與其他處理均無顯著差異。

微生物群落的豐富度(H')和優(yōu)勢度指數(shù)(1/D)在不同處理間表現(xiàn)出一致的規(guī)律,即雞糞沼液處理的數(shù)值最高,顯著高于其他處理(P<0.05),其次為牛糞沼液處理,其數(shù)值顯著高于豬糞沼液處理(P<0.05),而處于它們中間的對照處理則與二者均無顯著差異(圖4)。均一度指數(shù)(U)最高的也是雞糞沼液處理,但其僅顯著高于豬糞處理(P<0.05),與對照和牛糞沼液處理均無顯著差異。

2.4 微生物碳代謝群落排序分析

不同沼液處理下微生物碳代謝群落的差異程度如圖5所示。PCA 分析1 軸解釋度為28.38%,2 軸的解釋度為21.96%?？傮w而言豬糞沼液處理同對照的差異最大,相比而言牛糞和雞糞沼液對微生物群落代謝的影響較小。

2.5 土壤化學性狀與微生物指標的相關性分析

如表3所示,土壤理化性狀同微生物碳代謝的六大類碳源存在不同程度的相關性,其中相關性最強的為氨基酸,其同土壤硝態(tài)氮、全氮、速效鉀和電導率4 項均顯著(P<0.05)或極顯著負相關(P<0.01)。相比而言多樣性指標同各理化性狀不存在顯著的相關性。土壤微生物量碳含量與硝態(tài)氮及速效鉀呈顯著負相關關系(P<0.05),而微生物生物量氮含量同pH 和電導率呈顯著負相關關系(P<0.05)。

表3 土壤微生物指標與土壤化學性狀相關性分析Table 3 Correlation analysis between soil microbial indices and soil chemical properties

3 討論

施用沼液可有效提升土壤養(yǎng)分[5-6]。然而在本試驗中,3 個沼液處理的土壤有機質(zhì)含量與對照處理并無顯著差異。這主要與沼液的養(yǎng)分特性有關。盡管沼液中有機物質(zhì)豐富,但大多容易氧化分解而損失[24],且沼液中氮素以速效態(tài)為主[31-32],氮的投入促進了非自養(yǎng)微生物對有機碳的消耗[33],從而抵消了沼液攜帶有機物在土壤中的累積,這個結果與黃繼川等[24]在水稻田中沼液施用后土壤有機質(zhì)的表現(xiàn)一致。除有機質(zhì)外,各沼液處理中的其他土壤養(yǎng)分均呈現(xiàn)出不同程度的升高。值得注意的是,豬糞沼液處理中硝態(tài)氮的增幅最大,其次為雞糞沼液處理,這個結果可以由沼液中銨態(tài)氮和總氮的比率來解釋。經(jīng)計算,豬糞、雞糞和牛糞沼液的銨態(tài)氮與總氮比分別為0.86、0.67 和0.24(表1),在等氮投入的條件下豬糞沼液攜帶的銨態(tài)氮最多,沼液進入土壤后銨態(tài)氮迅速轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮[34],造成了豬糞沼液處理中土壤硝態(tài)氮含量最高的結果。

不同來源沼液不僅對土壤化學性狀產(chǎn)生了顯著的影響,也進一步影響了土壤中的微生物。土壤微生物量碳氮是土壤養(yǎng)分庫中最活躍的組分,也是植物可利用營養(yǎng)的重要來源[35],其對有機物料的投入反映敏感[36-37],常用來指示土壤肥力[38]。此前的報道證實沼液的投入有利于提高土壤微生物量碳[2,23,39-40]。然而在本研究中,僅牛糞的土壤微生物量碳略高于對照,且未達到顯著性水平。這可能與試驗條件有關,以上提及的研究均為田間試驗,周期較長,且有地上作物種植,本研究為室內(nèi)短期培養(yǎng)試驗,因此土壤中的生物化學過程可能同田間環(huán)境的存在較大差別[10,26]。此外,盡管氮素投入被認為是刺激土壤微生物量碳的關鍵因素[4],但沼液中大量銨態(tài)氮在短期內(nèi)有可能起到抑制微生物生長的作用。例如曹云等[41]研究發(fā)現(xiàn)盆栽體系中施用沼液后土壤中細菌數(shù)量并未增長,甚至有降低趨勢。在這個因素的作用下豬糞沼液造成了土壤微生物量碳的降低。相比之下,牛糞源沼液具有相對較高的碳氮比,使得更多的碳源進入土壤被微生物利用,一定程度上緩沖了抑制作用。由此可見,不同來源沼液對微生物生物量的影響存在差異。

基于微生物代謝功能的BIOLOG 微平板技術是一種常見的表征微生物群落和多樣性的方法[42],廣泛應用于土壤生態(tài)學研究[43]。該方法通過監(jiān)測不同種類微生物對單一碳源底物利用能力的差異,從而獲得土壤微生物群落結構和功能多樣性的信息[44],可作為預測土壤質(zhì)量變化的有力工具[45]。吸光度AWCD 值表征微生物利用碳源的整體能力[44,46]。在本研究中,與土壤微生物量碳表現(xiàn)相似的是,豬糞沼液處理的AWCD 值也受到了抑制,主要源于氨基酸(Ama)的降低。通過相關性分析的結果可知,Ama 的表現(xiàn)與豬糞沼液加入引發(fā)的土壤理化性狀變化密切相關。鄭學博等[25]也發(fā)現(xiàn)施用豬糞沼液可造成土壤微生物碳代謝強度輕微下降。相比之下,雞糞沼液施用引發(fā)了最高的微生物碳源利用,主要與碳水化合物、羧酸和胺類的升高有關。對碳源利用的差異更清晰地呈現(xiàn)在PCA 上,土壤微生物代謝功能的群落結構以豬糞沼液處理產(chǎn)生的影響最為明顯。

土壤微生物多樣性與地下生態(tài)系統(tǒng)功能密切相關[47],高多樣性往往預示著更好的土壤質(zhì)量。生物多樣性的指標繁多,本研究采用了常見的Shannon 豐富度、Simpson 優(yōu)勢度和McIntosh 均一度3 個指數(shù)[29]。Shannon 指數(shù)主要用于反映微生物群落的豐富程度;Simpson 指數(shù)與其相反,是對群落集中性的度量,并且側重于常見種類;McIntosh 指數(shù)則基于群落物種在多維空間上距離,是對均一性的度量。三者從不同側面評價土壤微生物群落的功能多樣性[30]。關于沼液對土壤微生物多樣性的影響,有的報道顯示施用沼液可顯著提高土壤微生物的多樣性[3,41,48],也有研究發(fā)現(xiàn)沒有顯著影響[2],甚至得出相反的結果[25]。上述不一致的結果,一方面與沼液的施用量有關[25],也可能與沼液的種類和自身的特性相關。本研究中3 個指數(shù)最高值均出現(xiàn)在雞糞沼液處理,反映出雞糞沼液有利于提高土壤微生物碳代謝的多樣性和均勻度,相比之下豬糞沼液表現(xiàn)出抑制的趨勢。然而,相關性分析顯示多樣性指標與監(jiān)測的各類土壤理化性狀指標均無顯著相關性。因此,尚不能判斷本試驗中引發(fā)處理間微生物碳代謝多樣性差異的因素。沼液中成分復雜,除了含有可供植物根系和土壤生物利用的養(yǎng)分外,還含有可影響地下生態(tài)系統(tǒng)運轉(zhuǎn)的微量元素、有機酸小分子,以及重金屬元素等物質(zhì)[16],這些指標在本研究的土壤分析中未涉及,但可能是影響微生物碳代謝的重要因子?？傮w上雞糞沼液和豬糞沼液對土壤微生物碳代謝的影響表現(xiàn)出相反的趨勢,雞糞沼液為促進作用,而豬糞沼液呈現(xiàn)出抑制效應。

值得注意的是,盡管本試驗采用的BIOLOG 微平板培養(yǎng)方法因方便快捷而受到廣泛應用,但這種方法也存在著一定的局限性[49],例如其不能反映微生物休眠體,或者那些不能利用BIOLOG 碳源底物的群體的情況[29];被測試的底物不能準確地代表土壤中出現(xiàn)的底物類型[49]。因此,這種方法只能粗略地反映土壤微生物群體底物利用的動力學特征[49],而對微生物種類和多樣性特征的呈現(xiàn)則相當有限。相比而言,分子生物學方法在這些方面更具有優(yōu)勢,宜在后續(xù)的研究中采用。此外,本研究為室內(nèi)培養(yǎng)試驗,探索的是沼液對土壤微生物的短期“激發(fā)”效應,但還不足以說明問題。沼液作為肥料資源,其農(nóng)學效應、環(huán)境效應以及土壤生物學效應,更需要得到田間數(shù)據(jù)的支撐。因此,未來宜轉(zhuǎn)入田間,并結合分子生物學方法開展研究,甚至可設置連續(xù)多年的試驗,以明確不同來源沼液肥料對土壤生物群落的長期影響。

4 結論

1)在短期的室內(nèi)培養(yǎng)試驗中,雞糞、牛糞和豬糞源沼液對土壤有機質(zhì)含量無顯著影響,但相比對照,各沼液處理對土壤無機氮、全氮、有效磷、速效鉀、pH 和電導率均起到了不同程度的促進效果。

2)土壤微生物生物量碳在牛糞沼液處理中最高,而豬糞沼液中微生物量碳則同對照相比顯著降低。

3)雞糞沼液引發(fā)了微生物最高的碳源利用強度,而豬糞沼液則表現(xiàn)出抑制的趨勢。相比其他處理,雞糞沼液顯著提高了土壤微生物的Shannon 豐富度和Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)。主成分分析表明豬糞沼液處理的微生物碳代謝群落同對照的差異最大,相比而言牛糞和雞糞沼液對微生物代謝群落的影響較小。