黃新新，李佳豪，李曉斌，李宏坤，賈怡琪，馬利鑫，李 超，賀林嬌

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】妊娠是復(fù)雜的持續(xù)性生理應(yīng)激過程，母體內(nèi)激素、免疫以及代謝等會(huì)發(fā)生明顯變化，且會(huì)出現(xiàn)低水平炎癥反應(yīng)以及胰島素抵抗現(xiàn)象[1-2]，導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥的產(chǎn)生。增加孕期腸道菌群多樣性，維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)對(duì)于緩解和治療孕期綜合癥具有一定的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】腸道菌群穩(wěn)態(tài)對(duì)于調(diào)控免疫、代謝等病理生理過程發(fā)揮重要作用，在妊娠期生理狀態(tài)發(fā)生適應(yīng)性重構(gòu)過程中扮演重要角色[3-4]。腸道菌群失調(diào)是導(dǎo)致妊娠期并發(fā)癥產(chǎn)生的因素之一[5]。而益生菌在防治妊娠期并發(fā)癥的過程中存在一定潛力[6]。馬寧等[7]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌對(duì)妊娠母畜的繁殖性能及胎兒的生長(zhǎng)性能有促進(jìn)功能，且益生菌還有助于調(diào)節(jié)妊娠母體的妊娠期糖尿病。Asemi Z等[8]研究顯示，益生菌通過調(diào)節(jié)血糖水平能抑制孕晚期胰島素濃度上升，減緩胰島素抵抗癥狀。Yeganegi M等[9]研究顯示，鼠李糖乳桿菌上清液GR-1可調(diào)節(jié)胎盤LPS的表達(dá)量，對(duì)孕期炎癥癥狀有減輕作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于益生菌對(duì)于妊娠母畜的研究主要集中在益生菌對(duì)母畜妊娠期疾病的影響，而針對(duì)益生菌對(duì)妊娠母畜腸道菌群的研究鮮見。而LGG具有調(diào)控腸道菌群、改變腸道環(huán)境和提高機(jī)體免疫能力等生物學(xué)作用[10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以孕期小鼠為研究對(duì)象，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組。在相同的飼養(yǎng)條件和日糧營養(yǎng)水平下，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上灌喂0.5 mL含有0.125 g鼠李糖乳桿菌的滅菌生理鹽水，試驗(yàn)期21 d。在整個(gè)妊娠通過灌喂鼠李糖乳桿菌探究其對(duì)妊娠小鼠糞便菌群多樣性和豐度的影響，為鼠李糖乳桿菌在整個(gè)妊娠周期的應(yīng)用提供新的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)選擇體重相近(23.33±1.55) g，配種日期相同的昆明妊娠小白鼠30只，采購于新疆醫(yī)科大學(xué)。

鼠李糖乳桿菌購自西安萬方生物科技有限公司，活菌數(shù)為1×1010CFU/g。

1.2 方 法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將30只妊娠小鼠隨機(jī)分為2組，每組15只，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組。在相同的飼養(yǎng)條件和日糧營養(yǎng)水平下，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組小鼠在飼喂基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上灌喂0.5 mL含有0.125 g鼠李糖乳桿菌的滅菌生理鹽水，在09:00進(jìn)行灌喂。試驗(yàn)期間每3只小鼠為一籠飼養(yǎng)，每組5個(gè)重復(fù)，隔天換墊料。試驗(yàn)進(jìn)行至小鼠臨產(chǎn)前，直腸采集小鼠糞便樣品。表1

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(以風(fēng)干物質(zhì)計(jì)，%)Table 1 Composition and nutrient levels of diet (Air-dry basis,%)

1.2.2 樣品采集

根據(jù)配種日期，臨產(chǎn)前1 d，直腸采集小鼠糞便樣品，同一組3只小鼠的樣品合為1個(gè)樣品，分裝于無RNA的凍存管內(nèi)，液氮冷凍保存。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

總DNA提取、PCR擴(kuò)增及Illumina HiSeq測(cè)序及結(jié)果分析均委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。最終結(jié)果以稀釋后的基因組DNA為模板，使用16S rDNA的V4區(qū)特異引物515F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

515F：5’-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’

806R：5’-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’

1.3 數(shù)據(jù)處理

在Excel中先將數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，在使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌喂鼠李糖乳桿菌對(duì)妊娠小鼠糞便中菌群ɑ多樣性的影響

研究表明，妊娠小鼠糞便中菌群α多樣性指數(shù)顯示對(duì)照組與試驗(yàn)組之間差異均不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別比對(duì)照組降低了13.27%(P>0.05)、6.25%(P>0.05)。以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs，共得到810個(gè)OTUs，對(duì)照組385個(gè)，試驗(yàn)組425個(gè)，共有OTUs 304個(gè)，特有的對(duì)照組71個(gè)，試驗(yàn)組111個(gè)。表2

表2 糞便菌群α-多樣性Table 2 Fecal flora α-diversity

2.2 灌喂鼠李糖乳桿菌對(duì)妊娠小鼠糞便中門水平物種豐度的影響

研究表明，在門水平上top 9的物種如下，妊娠小鼠糞便中的菌門分別為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、unidentified_Bacteria、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、藍(lán)細(xì)菌、酸桿菌門，其中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門的豐度之和在90%以上。小鼠糞便中厚壁菌門，試驗(yàn)組比對(duì)照組提高了20.12%(P<0.05)；但擬桿菌菌門和變形菌門試驗(yàn)組分別比對(duì)照組降低了21.95%(P<0.05)、26.15%(P<0.05)。表3

表3 門水平物種的豐度變化Table 3 Abundance of phylum level species (%)

2.3 灌喂鼠李糖乳桿菌對(duì)妊娠小鼠糞便中科水平物種豐度的影響

研究表明，在科水平上top 9的物種如下。在科水平上，妊娠小鼠糞便中的物種分別為毛螺菌科、Muribaculaceae、乳酸細(xì)菌科、韋榮球菌科、不明梭菌屬、脫硫弧菌科、理研菌科、普雷沃氏菌科。毛螺菌科、乳酸細(xì)菌科和韋榮球菌科試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中毛螺菌科和乳酸細(xì)菌科試驗(yàn)組分別比對(duì)照組提高了23.57%(P<0.05)和50.24%(P<0.05)。其它科水平的物種試驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)，但Muribaculaceae試驗(yàn)組比對(duì)照組降低了6.64%(P>0.05)。表4

表4 科水平物種的豐度變化Table 4 Abundance of family level species (%)

2.4 灌喂鼠李糖乳桿菌對(duì)妊娠小鼠糞便屬水平菌群豐度的影響

研究表明，在屬水平上top 9的物種如下，妊娠小鼠糞便中的物種分別為乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬、Candidatus_Arthromitus、Ileibacterium、Lachnoclostridium、Faecalibaculum、脫硫弧菌屬、Turicibacter、Alistipes、羅氏菌屬。乳酸桿菌屬、Lachnoclostridium與未確定毛螺菌科屬試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中乳酸桿菌屬與Lachnoclostridium試驗(yàn)組分別比對(duì)照組提高了50.05%(P<0.05)、46.62%(P<0.05)。其它屬水平的物種試驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)，但Candidatus_Arthromitus和Turicibacter試驗(yàn)組分別比對(duì)照組降低了20.34%(P>0.05)和12.86%(P>0.05)。表5

表5 屬水平物種的豐度變化Table 5 Abundance of species of genus level (%)

2.5 LEfSe

研究表明，在屬和種水平上對(duì)照組有差異的菌分別是Candidatus_Arthromitus和unidentified-Clostridiales。圖1

2.6 主坐標(biāo)分子

研究表明，圖中PC1為第一主坐標(biāo)，對(duì)檢測(cè)到的總細(xì)菌的代表性貢獻(xiàn)率為53.88%，PC2位第二主坐標(biāo)，貢獻(xiàn)率為21.60%。圖2

3 討 論

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnoides，LGG)屬于乳桿菌屬、鼠李糖乳桿菌種，為革蘭陽性兼性厭氧菌，是目前為止研究最廣的益生菌[11]。鼠李糖乳酸桿菌在調(diào)控腸道菌群和提高機(jī)體的免疫等方面有顯著作用[12]。妊娠期營養(yǎng)代謝需求增加，激素分泌水平改變，胃腸道發(fā)生系列重構(gòu)，腸道菌群組成也發(fā)生適應(yīng)性改變，來調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感性[13-15]。菌群失調(diào)刺激先天免疫系統(tǒng)，激活Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)和NOD樣受體(NOD-likereceptors，NLRs)，刺激腸上皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞，促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生[16]，炎癥遞質(zhì)破壞腸道屏障，腸腔滲透性增加，使腸道處于輕度慢性炎癥狀態(tài)，是導(dǎo)致孕期并發(fā)癥產(chǎn)生的原因之一。

妊娠期代謝機(jī)能發(fā)生變化，腸道菌群的構(gòu)成和豐度也隨之改變[17]。GOHIR等[18]發(fā)現(xiàn)正常飲食條件下，小鼠孕期某些優(yōu)勢(shì)菌豐度顯著增高，擬桿菌門相對(duì)豐度在整個(gè)孕期高于未孕鼠，雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)豐度在孕早期達(dá)頂峰，后逐漸下降至豐度與未孕鼠相似，艾克曼菌(Akkermansia)孕早期較為豐富，孕中晚期豐度下降。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在孕后期，門水平豐度較高的菌分別是厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、unidentified-Bacteria、軟壁菌門、脫鐵桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門和酸桿菌門。對(duì)照組和試驗(yàn)組厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的豐度之和分別是96.95%和97.16%。其中試驗(yàn)組厚壁菌門豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而擬桿菌門和變形菌門豐度菌顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。鼠李糖乳桿菌能夠提高妊娠后期小鼠糞便厚壁菌門的豐度。由于厚壁菌門豐度與擬桿菌門豐度呈一定比例關(guān)系[19]，使得試驗(yàn)中試驗(yàn)組擬桿菌門顯著低于對(duì)照組的原因。同時(shí)糞便中大多數(shù)的有益菌隸屬于厚壁菌門和擬桿菌門[20-21]，在試驗(yàn)中試驗(yàn)組厚壁菌門和擬桿菌門豐度升高可能是試驗(yàn)組變形菌門豐度降低的原因，鼠李糖乳桿菌能夠抑制腸道中有害菌的增殖，提高有益菌的豐度[22]。劉月靜[23]研究結(jié)果顯示，給正常雌性小鼠喂食鼠李糖乳桿菌菌液，在第0 d、第16 d和第24 d擬桿菌門逐漸增多；厚壁菌門先增多后減少，但整體比0 d時(shí)減少；而變形桿菌門逐漸減少。與試驗(yàn)結(jié)果有差異的原因，一方面試驗(yàn)僅采集妊娠后期小鼠的糞便，未對(duì)妊娠初期糞便菌群豐度做研究，無法判斷菌群豐度前后變化的規(guī)律；另一方面由于試驗(yàn)小鼠處于妊娠期，所以可能是導(dǎo)致與劉靜月[23]研究結(jié)果差異的原因。

在科水平試驗(yàn)組毛螺菌科、乳酸細(xì)菌科和韋榮球菌科豐度均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在屬水平，乳酸桿菌屬、Unidentified_Lachnospiraceae屬和Lachnoclostridium試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。郭佳汶等[24]研究結(jié)果顯示，給雄性小鼠補(bǔ)喂LGG，第4周LGG組的優(yōu)勢(shì)物種為Akkermansia屬(16.31%)、Lactobacillus屬(11.24%)Unidentifified_Lachnospiraceae屬(6.64%)。與試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌有差異主要可能與飼養(yǎng)管理、性別等有關(guān)。

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠糞便中Shannon、Simpson、Chao1和ACE試驗(yàn)組和對(duì)照組均無顯著性變化(P>0.05)。郭佳汶等[24]研究結(jié)果顯示，給雄性小鼠補(bǔ)喂LGG，試驗(yàn)第1周Shannon、Simpson、Chao1和ACE分別為2.02、0.60、366.06和385.76，試驗(yàn)第4周分別為5.17、0.93、283.28和281.63，隨著試驗(yàn)的進(jìn)行Shannon和Simpson在升高，而Chao1和ACE指數(shù)在降低，LGG對(duì)小鼠糞便菌群多樣性具有一定影響。

4 結(jié) 論

灌喂鼠李糖乳桿菌對(duì)小鼠糞便菌群多樣性無顯著性影響。在門水平上，厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的豐度之和在90%以上，厚壁菌門試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但擬桿菌菌門和變形菌門試驗(yàn)組分別比對(duì)照組降低了21.95%(P<0.05)、26.15%。在科水平上，毛螺菌科、乳酸細(xì)菌科和韋榮球菌科試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。在屬水平上，乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬與Lachnoclostridium試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組。給妊娠期小鼠灌喂鼠李糖乳桿菌，對(duì)小鼠糞便菌群多樣性無顯著性影響，但可以提高小鼠腸道細(xì)菌物種豐度，對(duì)厚壁菌門、毛螺菌科、乳酸細(xì)菌科、韋榮球菌科、乳酸桿菌屬、未確定毛螺菌科屬和Lachnoclostridium豐度具有顯著性影響。