許靜 梁翼 楊茂益 李強(qiáng)

[摘要] 目的 分析鋅指環(huán)指蛋白3（ZNRF3）在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）滑膜組織和細(xì)胞中表達(dá)及其與疾病發(fā)生的關(guān)系。

方法 選擇2018年3月—2020年3月我院收治的一側(cè)RA膝關(guān)節(jié)病變病人20例，根據(jù)病人病灶位置分為觀察組（RA側(cè)）與對(duì)照組（C側(cè)），收集兩組滑膜組織、成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）并鑒定滑膜細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）和Western blot方法檢測(cè)兩組滑膜組織和FLS中ZNRF3的mRNA和蛋白表達(dá)。

結(jié)果

RA病人觀察組的免疫組化評(píng)分、滑膜組織中ZNRF3的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.963～105.292，P<0.05）;RA側(cè)FLS中ZNRF3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于C側(cè)FLS，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=43.330、62.721，P<0.05）。

結(jié)論 RA病人病變側(cè)滑膜組織和FLS中的ZNRF3表達(dá)量明顯升高，可能與Wnt信號(hào)通路過度激活誘導(dǎo)ZNRF3生成增加，以及負(fù)反饋調(diào)節(jié)Wnt通路活性有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕;鋅指環(huán)指蛋白3;滑膜;滑膜細(xì)胞;Wnt信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R593.22

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號(hào)] 2096-5532（2021）05-0697-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.175

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211029.1732.004.html;2021-11-01 15：55：01

ZINC AND RING FINGER 3 EXPRESSION IN SYNOVIAL TISSUES AND CELLS OF RHEUMATOID ARTHRITIS AND ITS RELATIONSHIP WITH DISEASE OCCURRENCE

XU Jing， LIANG Yi， YANG Maoyi， LI Qiang

（Department of Rheumatology and Osteoarthritis， Sichuan Orthopedic Hospital， Chengdu 610041， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate zinc and ring finger 3 expression in synovial tissues and cells of rheumatoid arthritis （RA） and its relationship with disease occurrence.

Methods A total of 20 RA patients with unilateral knee joint disease in our hospital from March 2018 to March 2020 were selected， and classified into lesion side （Lesion） and control side （C）. The synovial tissues and fiber-like synovial cells （FLS） were collected， and synovial cells were identified. Then the expression of ZNRF3 in synovial tissues and FLS was analyzed.

Results The expression of synovial ZNRF3 in the immunohistochemical， qPCR and WB results of Lesion? group was significantly higher than that of C group （t=8.963-105.292，P<0.05）. The expression of ZNRF3 of Lesion-FLS in qPCR and WB results was significantly higher than that of C-FLS （t=43.330，62.721;P<0.05）.

Conclusion The high expression of ZNRF3 in synovial tissues and FLS of the affected side of RA patients is speculated to be related to the increased production of ZNRF3 caused by over-activation of Wnt signaling pathway， which can be improved through the negative feedback regulation of Wnt pathway activity.

[KEY WORDS] arthritis， rheumatoid; zinc and ring finger 3; synovial membrane; synoviocytes; Wnt signaling pathway

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是人體關(guān)節(jié)滑膜病變出現(xiàn)的慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病人出現(xiàn)不同程度關(guān)節(jié)破壞的疾病[1-2]。目前我國(guó)RA患病率為0.42%，病程越長(zhǎng)病人致殘率越高，其中病程超過15年者致殘率可高達(dá)61.3%[3-4]。既往資料顯示，成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）在RA病人中呈病態(tài)上升，而其凋亡下降，形成血管翳侵蝕軟骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙甚至喪失，嚴(yán)重影響病人身心健康及生活質(zhì)量[5-6]。在RA中，激活FLS由多信號(hào)通路決定，而Wnt信號(hào)通路具有重要性，被認(rèn)為參與了RA發(fā)生發(fā)展[6-7]。鋅指環(huán)指蛋白3（ZNRF3）是一種Wnt通路調(diào)控蛋白，可經(jīng)泛素化降解細(xì)胞膜表面Wnt蛋白受體卷曲蛋白，從而對(duì)Wnt信號(hào)通路活性產(chǎn)生抑制作用[8-9]。目前關(guān)于ZNRF3的研究主要集中于腫瘤細(xì)胞中，對(duì)RA研究較少。本研究探討ZNRF3在RA病人滑膜組織及細(xì)胞中表達(dá)，并分析其與疾病發(fā)生的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 對(duì)象選擇 2018年3月—2020年3月，選擇我院收治一側(cè)RA膝關(guān)節(jié)病變病人20例，男6例，女14例，年齡（44.32±9.65）歲。紅細(xì)胞沉降率為（39.84±16.56）mm/1 h，C反應(yīng)蛋白為（20.42±12.65）mg/L。根據(jù)病人病灶組織位置分為觀察組（病變側(cè)，RA側(cè)）與對(duì)照組（正常側(cè)，C側(cè)）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《2018中國(guó)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診療指南》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];②臨床資料完整;③正常組織側(cè)滑膜組織及檢測(cè)部位無外傷，無其他炎癥性疾病或一側(cè)關(guān)節(jié)慢性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他肌肉骨骼疾病者;②合并重要臟器疾病者。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人及家屬均知情同意。

1.1.2 主要試劑與儀器 包括免疫組化、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）、Western blot方法的主要試劑與儀器。儀器：Rigel S2流式細(xì)胞儀（上海睿鈺生物科技有限公司），微量分光光度儀（美國(guó)哈希，DR 6000型），光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯，CX43型），PCR儀（美國(guó)羅氏，LC480型）。試劑：Anti-ZNRF3一抗（上海瑞齊生物技術(shù)有限公司），ZNRF3二抗（微蒙上海生物科技有限公司），CD29、CD90抗體（英國(guó)BioLegend公司），Vimentin、CD68一抗（美國(guó)Santa Cruz公司），Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Sigma公司），TRIzal試劑（賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司），RT Master Mix試劑盒（上海力敏實(shí)業(yè)有限公司），GAPDH一抗（武漢賽維爾公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集與處理 采用膝關(guān)節(jié)穿刺術(shù)收集RA病人兩側(cè)滑膜。將滑膜組織置入含體積分?jǐn)?shù)為0.10雙抗磷酸鹽緩沖液（PBS）的離心管中（存放冰盒）送檢。在生物安全柜中采用體積分?jǐn)?shù)0.10的PBS清洗標(biāo)本，并分離標(biāo)本上血管和脂肪組織。將處理后標(biāo)本分3份：第1份用于多聚甲醛固定;第2份處理成小塊，放入凍存管中置液氮罐內(nèi)10 min，再置入-80 ℃冰箱中備用;第3份放入新培養(yǎng)皿中，用于提取FLS。

1.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色及評(píng)分 RA滑膜常規(guī)進(jìn)行HE染色后，采用光學(xué)顯微鏡觀察RA滑膜病理變化并記錄。滑膜HE染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.3 免疫組化染色 按照文獻(xiàn)方法[11]進(jìn)行免疫組化染色。采用光鏡高倍視野觀察細(xì)胞改變。免疫組化染色半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]如下。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：0分，無陽性細(xì)胞;1分，陽性細(xì)胞<25%;2分，陽性細(xì)胞25%～50%;3分，陽性細(xì)胞51%～75%;4分，陽性細(xì)胞>75%。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱評(píng)分：0分，無著色;1分，淡黃色;2分，棕黃色;3分，棕褐色。

1.2.4 FLS分離與培養(yǎng)及細(xì)胞鑒定 FLS分離及培養(yǎng)參考文獻(xiàn)方法[13]進(jìn)行。細(xì)胞鑒定采用PBS清洗第3代凍存FLS共2次，胰蛋白酶消化后終止消化。1 200 r/min離心5 min，去培養(yǎng)基、PBS清洗。加1 mL單細(xì)胞懸液，并加CD90、CD29抗體行免疫熒光染色，設(shè)陰性對(duì)照。避光孵育20 min，用PBS清洗，加緩沖重懸液，采用Rigel S2流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 qPCR檢測(cè) 提取細(xì)胞RNA后去培養(yǎng)基，PBS清洗后在培養(yǎng)板中滴入500 μL的RA2液混勻，吹打細(xì)胞移至內(nèi)套管內(nèi)。以12 000 r/min離心1 min，去外套管中液體，內(nèi)套管內(nèi)滴500 μL洗脫液;重復(fù)操作1次。棄外套管，將內(nèi)套管移入新EP管內(nèi)，在膜中央加入洗脫液30 μL，室溫下靜置后以12 000 r/min離心1 min，獲取細(xì)胞總RNA。取100 mg組織剪碎研磨，加入1 mL的TRIzal震蕩30 s，室溫放置至組織裂解。以8 500 r/min離心5 min取上清液，加氯仿200 μL，震蕩30 s，室溫放置;再離心15 min取上清液，加等量異丙醇，室溫靜置10 min，再離心10 min，棄上清液，加500 μL體積分?jǐn)?shù)0. 75的乙醇，離心5 min; 重復(fù)此操作。將沉淀存放室溫晾干，加10～20 μL的 DEPC液溶解RNA后，提取組織RNA。應(yīng)用微量分光光度儀分別檢測(cè)細(xì)胞和組織RNA濃度。使用 RT Master Mix試劑盒，反轉(zhuǎn)錄cDNA保存于-20 ℃冰箱中備用。qPCR反應(yīng)采用兩步法進(jìn)行：①預(yù)變，195 ℃條件下持續(xù)30 s;②PCR，40、90 ℃條件下進(jìn)行5 s反應(yīng)或60 ℃條件下進(jìn)行30 s反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系按照試劑盒說明配制，所用引物及其序列見表2。

1.2.6 Western blot方法 細(xì)胞、組織蛋白提取后備用。取電泳緩沖液粉，參照說明書溶解于1 L純水內(nèi)制成電泳緩沖液。200 A電泳90 min轉(zhuǎn)膜后，取出膜用50 g/L脫脂牛奶室溫閉封2 h。加入一抗（1∶2 000 GAPDH抗體，1∶1 000 ZNRF3抗體）4 ℃冰箱搖床上搖動(dòng)孵育10 h。次日洗膜3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，再洗膜3次。取ECL試劑A、B底物液1∶1混勻，將沖洗后的膜置入避光反應(yīng)后進(jìn)行顯影。使用Adobe Photoshop測(cè)量各條帶灰度值，采用相對(duì)灰度值表示蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 兩側(cè)滑膜組織HE染色評(píng)分比較

觀察組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生和新生血管形成等評(píng)分均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=54.243～98.522，P<0.05）。見表3和圖1。

2.2 FLS細(xì)胞形態(tài)觀察

本研究觀察到FLS細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中部，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、星形和紡錘狀，邊界清晰，周圍見聚集性分泌物，還混雜卵圓形巨噬樣滑膜細(xì)胞（MLS）。細(xì)胞傳至第3代，MLS分裂、增殖作用喪失，其后FLS、RA-FLS、C-FLS細(xì)胞形態(tài)相似。從原代FLS細(xì)胞圖可見觀察組（圖2a、b）生長(zhǎng)速度較對(duì)照組（圖2c、d）增快。

2.3 FLS細(xì)胞鑒定

本研究的細(xì)胞檢測(cè)抗體為CD90、CD29，用于第3代RA-FLS、C-FLS細(xì)胞鑒定，若兩者陽性率超過90%，則表示提取細(xì)胞為純化FLS。本文檢測(cè)結(jié)果表明，CD90、CD29兩者陽性率為93.19%，提示提取細(xì)胞為純化FLS。見圖3。

2.4 ZNRF3在病人兩側(cè)滑膜組織表達(dá)比較

ZNRF3在觀察組的免疫組化評(píng)分、mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.963～105.292，P<0.05）。見表4和圖4。

2.5 ZNRF3在病人兩側(cè)滑膜FLS細(xì)胞中的分布與表達(dá)

免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，ZNRF3（熒光綠）在RA-FLS和C-FLS的質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，但RA-FLS的熒光明顯強(qiáng)于C-FLS。見圖5。qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，ZNRF3在RA-FLS的mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯高于C-FLS，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=43.330、62.721，P<0.05）。見表5和圖6。

3 討? 論

ZNRF3是一種調(diào)控蛋白，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)與R脊柱蛋白相互作用，與富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體生成復(fù)合物，致使ZNRF3自動(dòng)膜清除、泛素化，使胞膜表面卷曲受體蛋白穩(wěn)定，維持Wnt信號(hào)活性通路;細(xì)胞表面ZNRF3結(jié)合巢亂蛋白某區(qū)，識(shí)別Wnt巢亂蛋白，誘導(dǎo)該蛋白泛素化降解，從而抑制Wnt信號(hào)通路[14-16]。有學(xué)者認(rèn)為，ZNRF3對(duì)Wnt/β-catenin、Wnt/PCP信號(hào)通路呈負(fù)性調(diào)控性[17]。

目前關(guān)于ZNRF的研究以腫瘤為主。已有學(xué)者指出，在腫瘤疾病中R-spondin-ZNRF3板塊常發(fā)生突變[18]。有研究表明，ZNRF3對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控屬負(fù)性，其在腫瘤組織中表達(dá)不盡相同[19]。有學(xué)者對(duì)乳頭狀甲狀腺癌組織與正常甲狀腺組織的研究結(jié)果顯示，ZNRF3在乳頭狀甲狀腺癌組織內(nèi)呈下調(diào)，且與其分化等級(jí)呈負(fù)相關(guān)[20-21]。而ZNRF3在原發(fā)性結(jié)直腸癌表達(dá)上調(diào)[22]。ZNRF3在骨關(guān)節(jié)的研究有待明確，但考慮RA病變與Wnt信號(hào)通路存在聯(lián)系，推測(cè)ZNRF3可能與RA病變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

本研究對(duì)膝關(guān)節(jié)RA病人的RA側(cè)與C側(cè)滑膜組織、細(xì)胞采用免疫組化、qRCR和Westen blot法研究顯示，病人RA側(cè)滑膜組織中ZNRF3表達(dá)高于C側(cè)。相關(guān)研究已表明，RA側(cè)Wnt信號(hào)通路與其組織發(fā)病有關(guān);在RA側(cè)組織、FLS中，β-catenin表達(dá)上調(diào)，表示W(wǎng)nt通路過度激活，并抑制RA側(cè)的成骨細(xì)胞[23-25]。由此推測(cè)，ZNRF3在RA側(cè)滑膜組織中表達(dá)增高與Wnt信號(hào)通路在滑膜炎癥中過度激活相關(guān)，ZNRF3在RA發(fā)病中可抑制被過度激活的Wnt通路，而且呈負(fù)增長(zhǎng)表達(dá)[26-27]。進(jìn)一步分析ZNRF3在RA發(fā)病中的作用，采用酶消法從滑膜組織中分離原代FLS細(xì)胞，使用Ⅱ型膠原酶將組織離散成單個(gè)細(xì)胞，并用含F(xiàn)BS培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天，使細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%[28-30]。本文光鏡下觀察顯示，經(jīng)HE染色的RA側(cè)滑膜組織明顯增生，細(xì)胞

層數(shù)增加，并見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜間質(zhì)中，且伴大量新生血管生成，部分組織中見淋巴濾泡形成、間質(zhì)纖維化。本文應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)、免疫熒光檢測(cè)對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并觀察ZNRF3在FLS中的表達(dá)，結(jié)果顯示，RA-FLS和C-FLS中ZNRF3均定位于細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜，RA-FLS中ZNRF3表達(dá)明顯增高，而C-FLS中無明顯表達(dá)，qRCR與Westen blot檢測(cè)結(jié)果也相同。上述結(jié)果均提示，激活Wnt信號(hào)通路后可誘導(dǎo)ZNRF3生成并在細(xì)胞核外分泌，從而調(diào)控Wnt信號(hào)通路活性。

總而言之，RA病人病變側(cè)滑膜組織、FLS中的ZNRF3表達(dá)量升高，推測(cè)與Wnt信號(hào)通路過度激活誘導(dǎo)ZNRF3生成增加有關(guān)，而ZNRF3高表達(dá)可負(fù)反饋調(diào)節(jié)Wnt通路活性。

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