蔣欣 曲青山 梁韶峰 房軍 孫東

[摘要] 目的 探討川芎素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷（I/R）保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法 雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R組、川芎素組（10 μmol/kg腹腔注射，LC組）、LC+Notch1通路激活劑rhNF-κB組（LC+rhNF-κB組），每組15只。觀察各組血尿素氮（BUN）和血清肌酐（Scr）水平，采用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）方法檢測腎組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，免疫組化和Western blot檢測腎組織Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表達(dá)水平。

結(jié)果 I/R組腎組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2、Notch1、Jagged1的表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組（P均<0.05），而LC組中上述蛋白的表達(dá)均顯著低于I/R組（P均<0.05）。另外，LC+rhNF-κB組中BUN、Scr、TNF-α、IL-6、Caspase3、Bax/Bcl-2的表達(dá)與LC組相比均顯著上調(diào)（P均<0.05）。

結(jié)論 川芎素通過抑制Notch1活化抑制腎組織的損傷和炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 再灌注損傷;急性腎損傷;川芎嗪;受體，Notch1;炎癥;大鼠，Sprague-Dawley

[中圖分類號] R619.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0725-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.172

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211101.0853.001.html;2021-11-01 11：51：01

ROLE OF SODIUM FERULATE IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN RATS AND ITS MECHANISM

JIANG Xin， QU Qingshan， LIANG Shaofeng， FANG Jun， SUN Dong

（Department of Organ Transplantation， Zhengzhou Peoples Hospital， Zhengzhou 450000， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of sodium ferulate against renal ischemia-reperfusion （I/R） injury in rats and its mechanism.

Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group， I/R group， sodium ferulate group （10 μmol/kg by intraperitoneal injection）， and sodium ferulate+Notch1 pathway activator rhNF-κB group （sodium ferulate+rhNF-κB group）， with 15 rats in each group. The levels of blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Scr） were observed for each group; quantitative real-time PCR and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in renal tissue; immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression levels of Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 in renal tissue.

Results

Compared with the sham-operation group， the I/R group had severe structural damage of renal tissue and significantly higher expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， Bax/Bcl-2， Notch1， and Jagged1 （all P<0.05）， and the sodium ferulate group had significantly lower expression levels of the above proteins than the I/R group （all P<0.05）. In addition， compared with the sodium ferulate group， the sodium ferulate+rhNF-κB group had significantly upregulated expression levels of BUN， Scr， TNF-α， IL-6， Caspase3， and Bax/Bcl-2 （all P<0.05）.

Conclusion Sodium ferulate inhibits renal tissue injury and inflammation by inhibiting the activation of Notch1.

[KEY WORDS] reperfusion injury; acute kidney injury; Tetramethylpyrazine; receptor， Notch1; inflammation; rats， Sprague-Dawley

腎臟缺血再灌注損傷（I/R）是引起急性腎損傷（AKI）的主要病因[1]。AKI和腎I/R均導(dǎo)致腎功能迅速下降[2-3]，但目前缺乏預(yù)防或治療AKI的有效策略[3]。腎I/R發(fā)展過程涉及活性氧（ROS）的產(chǎn)生、促炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡等[4-7]，且導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的損傷[8-9]。細(xì)胞凋亡是腎臟I/R中腎小管上皮細(xì)胞死亡的主要類型[10]。長期以來川芎一直被應(yīng)用于心血管疾病的治療，如卒中[11]和冠心病[12]，特別是在我國、日本和韓國應(yīng)用廣泛[13]。已有研究結(jié)果表明，川芎素（LC）可以保護(hù)急性缺血性腎損傷[14]，而鮮見其對缺血后再灌注腎損傷保護(hù)作用的研究。因此，本研究的目的是探討LC對大鼠腎I/R的保護(hù)作用，并探討Notch通路對大鼠腎臟I/R中介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的作用及其可能機(jī)制，為LC作為治療腎臟I/R的新策略提供數(shù)據(jù)支持?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選擇健康雄性、SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體質(zhì)量211～248 g，購于我院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，動物自由飲食、飲水。本研究嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》的執(zhí)行原則。

1.1.2 主要試劑及藥物 LC購于中國河北安國神農(nóng)中草藥公司;兔抗大鼠的腫瘤壞死因子α（TNF-α）（ab6671）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（ab208113）、半胱天冬酶3（Caspase3）（ab13847）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病相關(guān)X的蛋白（BAX）（ab32503）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）（ab196495）、缺口蛋白1（Notch1）（ab52301）、鋸齒狀蛋白1（Jagged1）（ab233101）的第一抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔第二抗體（ab6721）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，ab9485）等均購于美國Abcam公司;SYBR Green qPCR Master Mix試劑購于MedChemExpress公司;組織蛋白抽提試劑購自上海碧云天生物科技有限公司。血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）試劑盒購于美國R&D Systems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（a組）、I/R組（b組）、LC組（c組）和LC+Notch1通路激活劑rhNF-κB組（LC+rhNF-κB組，d組），每組15只。

1.2.2 模型建立及標(biāo)本采集 大鼠術(shù)前禁食8 h，不禁水，100 g/L水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉。常規(guī)固定、消毒、鋪巾，腹正中切口，游離腎蒂，I/R組以無創(chuàng)小血管夾同時(shí)夾閉雙側(cè)腎蒂50 min，之后松開血管夾，讓血流再通。假手術(shù)組、LC組、LC+rhNF-κB組大鼠手術(shù)方式與I/R組相同，但假手術(shù)組不用血管夾阻斷血流，而LC組、LC+rhNF-κB組在松開血管夾時(shí)予LC（10 μmol/kg）腹腔注射，I/R組與假手術(shù)組則以等量生理鹽水注射液腹腔注射。各組分別于再灌注6、12、24、48 h共4個時(shí)點(diǎn)取血標(biāo)本（腹主動脈穿刺），在48 h取腎臟組織標(biāo)本。右腎用冰生理鹽水沖洗后置液氮保存，行實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western blot）檢測;左腎用40 g/L甲醛固定緩沖液固定，待制備石蠟切片。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測 將血清保存在-80 ℃冰箱，通過ELISA試劑盒檢測血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE）和免疫組織化學(xué)染色 按照HE染色試劑盒說明將5 μm腎組織石蠟切片進(jìn)行HE染色。使用常規(guī)免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測Notch1在腎臟組織表達(dá)，Notch1抗體的稀釋度為1∶100。使用GTVsionTM Ⅲ檢測系統(tǒng)（GK5007，Gene Tech，中國）記錄所有IHC圖像。

1.2.5 qRT-PCR檢測 按照TianGen試劑盒說明書步驟提取大鼠腎組織總RNA，并按照TAKARA（RR047A）試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參照SYBR Green Master Mix PCR試劑盒說明進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，所用引物及其序列見表1。以人GAPDH基因作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算IL-6和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測 按照RIPA裂解緩沖液試劑盒說明書提取腎臟組織的總蛋白，并使用BCA試劑盒檢測濃度。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作后，分別孵育TNF-α（1∶600）、IL-6（1∶600）、Caspase3（1∶500）、Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶400）、Notch1（1∶500）和Jagged1（1∶500）抗體和對應(yīng)的二抗。蛋白條帶顯色后，用Image J軟件分析比較目的條帶/內(nèi)參照（GAPDH）條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。其中計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用±s的形式表示，兩組均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本比較的t檢驗(yàn);多組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，均數(shù)兩兩之間的比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 I/R模型大鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能變化

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)無明顯形態(tài)學(xué)改變;而與假手術(shù)組相比，I/R組的腎組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重破壞，包括腎小管擴(kuò)張、腎上皮細(xì)胞扁平、刷狀緣喪失和核染色喪失等（圖1A）。另外，I/R組大鼠血BUN和Scr水平在12、24和48 h等3個時(shí)間點(diǎn)均明顯高于假手術(shù)組，差異均有顯著性（t=10.532～17.693，P均<0.05）。見圖1B。

2.2 LC對I/R大鼠腎組織結(jié)構(gòu)和Notch1信號通路的影響

HE染色結(jié)果顯示，與I/R組相比，LC組破壞的腎組織的結(jié)構(gòu)有明顯恢復(fù);與I/R+LC組相比，I/R+LC+rhNF-κB組的腎組織結(jié)構(gòu)破壞又加重。見圖2A。腎組織中的Notch1和Jagged1表達(dá)檢測結(jié)果顯示，4組Notch1和Jagged1的均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=256.311、189.106，P均<0.05）。兩兩比較的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比較，I/R組中Notch1和Jagged1在腎組織中表達(dá)上調(diào)（P均<0.05）;與I/R組相比， LC組Notch1和Jagged1的表達(dá)下調(diào)（P均<0.05）;使用Notch1信號激活劑rhNF-κB處理后與LC組相比，LC+rhNF-κB組的Notch1和Jagged1的表達(dá)明顯恢復(fù)（P均<0.05），見圖2B～E。另外，4組的BUN、Scr均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=182.060、183.772，P均<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與I/R組相比，在LC組中BUN、Scr水平降低（P均<0.05）;但是與LC組相比較，LC+rhNF-κB組的BUN、Scr水平又增加，但并未超過I/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。見圖2F。

2.3 LC對I/R大鼠腎臟炎癥相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響

本文4組腎臟組織IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)差別有顯著意義（F=203.012、214.310，P均<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組腎臟組織IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)升高（P均<0.05）;而與I/R組相比，LC組腎臟組織IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB組IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)部分恢復(fù)（P均<0.05）。見圖3A、B。4組大鼠腎臟組織IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平差異有顯著意義（F=113.412、128.204，P均<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，I/R組腎臟組織IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平升高（P均<0.05）;而與I/R組相比，LC組腎臟組織IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平降低（P均<0.05）;但是LC+rhNF-κB組IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平部分恢復(fù)（P均<0.05）。見圖3C～F。

2.4 LC對I/R大鼠腎臟細(xì)胞凋亡相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響

本文4組Caspase3和Bax/Bcl-2表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=156.205、143.337，P均<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，Caspase3和Bax/Bcl-2在I/R組的表達(dá)均高于假手術(shù)組（P均<0.05），而二者在LC組的表達(dá)均低于I/R組（P均<0.05），二者在LC+rhNF-κB組大鼠腎組織表達(dá)均高于LC組（P均<0.05）。見圖4A～C。

3 討? 論

AKI是一種潛在的致命疾病，病人死亡率高。腎臟I/R是AKI的主要原因[15]。有研究顯示，當(dāng)腎動脈灌注壓力處于10.64～23.94 kPa范圍時(shí)，腎血流將隨著灌注壓力的變化相應(yīng)地變化。但是，當(dāng)灌注壓力低于10.64 kPa時(shí)，腎血流量急劇降低，形成缺血并造成不可逆性損傷[16]。不幸的是，唯一合適的治療方法是腎移植和腎透析。因此，迫切需要找到一種有效的藥物來預(yù)防或者治療I/R。LC可能對AKI具有保護(hù)作用，但是否能夠改善腎I/R仍不明確。因此，我們分析了在體內(nèi)LC對腎I/R大鼠的影響。結(jié)果表明，LC可通過抑制Notch1活化，抑制I/R大鼠的腎組織損傷和炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是腎I/R的另一個明顯的特征，I/R可以引發(fā)腎臟炎性細(xì)胞增多、促炎性因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）的水平升高以及黏附分子增加，這些因子共同作用激發(fā)炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，放大局部炎癥反應(yīng)，甚至引起器官損傷[17]。本研究檢測腎I/R后腎組織中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明，無論在血清中還是在腎臟組織中炎癥因子的表達(dá)水平都伴隨著I/R過程增加。已有相關(guān)研究同樣觀察到，大鼠腎I/R后炎癥因子表達(dá)增加[18]。

Notch1信號通路存在于多種動物體內(nèi)，影響機(jī)體的發(fā)育和細(xì)胞分化、增殖、凋亡等，并參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[19-20]，與腎臟炎癥級聯(lián)反應(yīng)增加具有密切關(guān)系[21]。本文的研究結(jié)果也表明，LC能夠改善I/R腎功能和腎組織的形態(tài)變化，而這些保護(hù)作用可能通過調(diào)節(jié)Notch1信號通路活化實(shí)現(xiàn)的。首先，Notch1信號通路蛋白Notch1和Jagged1的表達(dá)水平在I/R組中表達(dá)顯著上調(diào)，而已有研究表明Notch1信號激活能夠加劇I/R的損傷[22]。本研究結(jié)果則顯示，LC腹腔注射能夠明顯抑制I/R導(dǎo)致的Notch1和Jagged1的上調(diào)，當(dāng)使用Notch1信號通路激活劑rhNF-κB時(shí)，LC的作用明顯被削弱。其次，I/R腎組織中IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)同樣被LC所抑制，LC的作用也可被rhNF-κB部分逆轉(zhuǎn)。表明LC也可能通過抑制Notch1信號減弱I/R的炎性損傷。

由于雄性激素更容易使腎臟受到I/R侵害，因此本研究采用雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象[23]。而本實(shí)驗(yàn)對腎I/R大鼠的研究表明，I/R增加了Scr和BUN的水平，加重了腎組織學(xué)損傷。另外，I/R增加了腎組織Caspase3和Bax/Bcl-2的表達(dá)，通過HE染色也觀察到細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡特征，這表明I/R能夠誘導(dǎo)更多腎組織細(xì)胞凋亡。LIU等[24]觀察到I/R對大鼠腎臟的損傷特征與本研究結(jié)果一致。值得注意的是，LC注射后I/R組的腎臟組織形態(tài)具有明顯的改善，與此同時(shí)I/R組大鼠中血BUN和Scr的高水平及腎組織中的凋亡標(biāo)記物Caspase3和Bax/Bcl-2都被LC所抑制。已有研究結(jié)果表明，LC對系膜細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞中的Caspase3和Bax/Bcl-2水平具有同樣的調(diào)節(jié)作用[25-26]。而且Notch1信號被敲低后可以抑制足細(xì)胞的Bcl-2依賴性凋亡[27]。而本研究反向驗(yàn)證中使用rhNF-κB激活Notch1信號通路后，LC對腎組織Caspase3和Bax/Bcl-2的抑制作用被減弱。以上研究結(jié)果表明，LC通過抑制Notch1信號可能減弱I/R腎組織的Caspase3和Bax/Bcl-2依賴的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LC可通過抑制Notch1信號保護(hù)I/R腎臟損傷。LC治療后，腎組織中促炎性細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）和促凋亡蛋白（Caspase3和Bax/Bcl-2）的表達(dá)下調(diào)。rhNF-κB激活Notch1信號后，該保護(hù)作用減弱。但本研究仍存在大鼠樣本量較少、動物模型較單一等缺點(diǎn)。因此，今后仍需加大動物樣本量，或者以不同方法，或者以多種模式動物構(gòu)建I/R模型進(jìn)一步驗(yàn)證LC對腎臟I/R的保護(hù)作用。本研究可為腎臟I/R的保護(hù)提供新的治療策略和研究靶點(diǎn)。但是LC的保護(hù)作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步在體外和體內(nèi)進(jìn)行研究。

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（本文編輯 于國藝）