李淵博，李小建，張靜濤，王 洋，強(qiáng) 毅，張 波，呂昌偉

（西北大學(xué)附屬醫(yī)院?西安市第三醫(yī)院骨科，陜西西安 710018）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種常見的慢性自身免疫性炎癥疾病[1]。早期RA多表現(xiàn)為四肢小關(guān)節(jié)的滑膜炎癥，隨著病程進(jìn)展，后期可破壞關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1]。RA病理機(jī)制尚不清楚，目前仍缺乏徹底治愈RA的方法[1]。腫瘤壞死因子-α(tummor necrosis factor-α,TNF-α)是RA中極其重要的病理炎癥因子，通過多種方式參與RA關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病程進(jìn)展[2]。多個(gè)臨床研究表明，TNF-α單抗，如英夫利昔單抗（infliximab,IFX）、依那西普（etanercept,ETN）及阿達(dá)木單抗（adalim?umab,ADA）等均可顯著延緩RA病程進(jìn)展[3]。

IFX是一種人/鼠嵌合型單克隆抗體，可特異性地與具有生物學(xué)活性的TNF-α結(jié)合，抑制其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)控作用[4]。IFX目前主要應(yīng)用于RA、銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩病等免疫炎性疾病[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在RA發(fā)病初期，聯(lián)合使用IFX和甲氨蝶呤（methotrexate,MTX）可有效抑制滑膜炎癥，減少關(guān)節(jié)破壞，且療效優(yōu)于單獨(dú)使用MTX后病情控制不佳而加用IFX者[6]。此外，IFX還應(yīng)用于其他TNF-α抑制劑無效者，如ADA或ETN等[7]。因此，IFX對(duì)于控制RA病情，尤其是RA發(fā)病初期尤為重要，然而臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，仍有部分RA患者對(duì)IFX原發(fā)性或繼發(fā)性不應(yīng)答[8]。目前，IFX治療RA不應(yīng)答的分子機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞自噬是生物進(jìn)化過程中的自我調(diào)節(jié)機(jī)制，具有高度保守性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中自噬的增強(qiáng)可降低抗腫瘤藥療效，與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。自噬在RA滑膜組織中表達(dá)增強(qiáng)，抑制自噬后MTX誘導(dǎo)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡增加，RA中增強(qiáng)的自噬降低了MTX療效，因此推測(cè)自噬也可能與IFX治療RA不應(yīng)答相關(guān)[10]。本研究從GEO(gene expres?sion omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫下載IFX治療RA不應(yīng)答數(shù)據(jù)集，從自噬角度出發(fā)，利用R語言分析差異表達(dá)自噬相關(guān)基因，使用單因素Logistic回歸、Lasso(least absolute shrinkage and selection operator,Lasso)回歸及多因素Logistic回歸等方法，篩選特征自噬相關(guān)基因，繪制受試者工作特征曲線(receiver operating char?acteristic curve,ROC)，分析特征自噬相關(guān)基因的診斷價(jià)值；在RA臨床樣本中對(duì)篩選出的基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，在RA滑膜細(xì)胞系中高表達(dá)特征基因后檢測(cè)細(xì)胞自噬情況。本研究通過篩選IFX治療RA不應(yīng)答自噬相關(guān)標(biāo)志物，并對(duì)相關(guān)基因功能進(jìn)行初步探索，為進(jìn)一步研究IFX治療RA不應(yīng)答的分子機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及樣本IFX治療RA不應(yīng)答納入排除標(biāo)準(zhǔn)：RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2010年美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（American Rheumatism Association,ARA）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（European League Against Rheumatism,EULAR）修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，通過詢問病史、臨床檢查和X線平片等確診RA患者；所有納入的RA患者均為首次治療RA，在此之前6個(gè)月內(nèi)未因其他疾病服用或外用任何抗風(fēng)濕藥，如激素、非甾體類抗炎藥、改變病程類抗風(fēng)濕藥等，未服用或外用抗風(fēng)濕相關(guān)中草藥及其制劑；排除同時(shí)患有其他免疫相關(guān)疾病者，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強(qiáng)直性脊柱炎等以及同時(shí)患有嚴(yán)重心腦血管疾病及對(duì)IFX治療過敏者。IFX不應(yīng)答及應(yīng)答定義：RA患者初次單獨(dú)使用IFX或聯(lián)合MTX治療至少12周，而DAS28?CRP（Dis?ease Activity Score in 28 joints with C-reaction protein level,DAS28?CRP）評(píng)分降低幅度小于或等于2.6分者為IFX不應(yīng)答，大于2.6者為IFX應(yīng)答。入組的RA患者均收集IFX治療前及治療12周后的外周血白細(xì)胞，所有患者均來自于西安市第三醫(yī)院，均書面簽署知情同意書。

1.2 GEO數(shù)據(jù)GEO數(shù)據(jù)庫中下載IFX治療RA不應(yīng)答數(shù)據(jù)，包括兩個(gè)數(shù)據(jù)集，GSE78068和GSE58795，其中數(shù)據(jù)集GSE78068作為訓(xùn)練集和內(nèi)部驗(yàn)證集，包含IFX不應(yīng)答患者98人，應(yīng)答者42人；GSE58795作為外部驗(yàn)證集，包括不應(yīng)答者23人，應(yīng)答者36人。

1.3 數(shù)據(jù)處理及差異自噬相關(guān)基因的篩選使用R語言limma包對(duì)GSE78068和GSE58795數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選IFX治療RA不應(yīng)答者與應(yīng)答者間差異表達(dá)基因。自噬相關(guān)基因集來源于人類自噬數(shù)據(jù)庫（Human Autophagy Database,HADb,http://www.autophagy.lu/index.html）和基因富集分析網(wǎng)站（Gene Set Enrichment Analysis website,GSEA,http://software.broadinsti?tute.org/gsea/index.jsp）中的GO_AUTOPHAGY基因集，將上述兩數(shù)據(jù)庫自噬相關(guān)基因集合并作為最終自噬相關(guān)基因集。使用R語言ggplot2包繪制火山圖，直觀展示GSE78068數(shù)據(jù)集中自噬相關(guān)基因。

1.4 GSEA分析使用R語言clusterProfiler包，以上述最終自噬相關(guān)基因集為參考基因集，對(duì)GSE78068數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA分析，并使用R語言enrichplot包進(jìn)行可視化。

1.5 IFX不應(yīng)答標(biāo)志物的篩選將數(shù)據(jù)集GSE78068和GSE58795中差異表達(dá)基因（P<0.05）與自噬相關(guān)基因集取交集，并使用R語言VennDiagram包可視化共同基因。在訓(xùn)練集GSE78068中使用單因素Logistic回歸分析、Lasso回歸及多因素Logistic對(duì)上述共同基因做進(jìn)一步篩選。GSE78068作為內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，GSE58795作為外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集，使用R語言pROC包對(duì)篩選出的基因構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型繪制ROC曲線，用以評(píng)估篩選出的自噬相關(guān)基因的診斷價(jià)值。

1.6 標(biāo)志物在RA患者外周血中的表達(dá)使用Realtime PCR檢測(cè)RA患者中IFX應(yīng)答者與不應(yīng)答者治療前外周血白細(xì)胞中自噬標(biāo)志物的表達(dá)。

1.7 標(biāo)志物對(duì)MH7A細(xì)胞自噬的影響構(gòu)建自噬標(biāo)志物高表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染人類滑膜細(xì)胞系MH 7A細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B和P62表達(dá)（均購于美國(guó)Sigma-Aldrich公司），用以檢測(cè)篩選出的標(biāo)志物對(duì)細(xì)胞自噬的影響。MH7A細(xì)胞轉(zhuǎn)染高表達(dá)載體后48 h，裂解液提取蛋白并使用BCA法定量，使用SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至NC膜，100 g/L牛奶室溫封閉2 h。加入一抗（LC3B稀釋濃度1∶1 000，P62稀釋濃度1∶3 000，內(nèi)參基因β-actin稀釋濃度為1∶1 000），4℃過 夜，TBST洗 膜 后 滴 加 二 抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Real-time PCR和Western blotting結(jié)果根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型采用Unpairedttest或Mann WhitneyUtest進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 自噬相關(guān)基因在應(yīng)答組與不應(yīng)答組間的差異分析利用R語言對(duì)數(shù)據(jù)集GSE78068和GSE58795進(jìn)行預(yù)處理后，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，使用limma包分析IFX治療RA不應(yīng)答與應(yīng)答者間差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示，GSE78068數(shù)據(jù)集中共有1 452個(gè)差異表達(dá)基因，GSE58795數(shù)據(jù)集共有3 664個(gè)差異表達(dá)基因。將HADb數(shù)據(jù)庫中自噬相關(guān)基因和GSEA數(shù)據(jù)庫中GO_AUTOPHAGY基因集合并，得到最終自噬相關(guān)基因集，作為后續(xù)分析的自噬參考基因集，共包含531個(gè)基因。使用該自噬參考基因集對(duì)GSE78068數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示自噬參考基因集主要高表達(dá)于不應(yīng)答組（圖1A），自噬相關(guān)基因火山圖表明部分自噬相關(guān)基因在應(yīng)答組與不應(yīng)答組間差異表達(dá)（P<0.05，圖1B）。以上結(jié)果表明自噬可能在IFX治療RA不應(yīng)答中發(fā)揮著作用。

圖1 自噬相關(guān)基因在IFX應(yīng)答者與不應(yīng)答者間的差異分析Fig.1 Differentially expressed autophagy-related genes(ARGs)between IFX treatment of RA non-responders and responders

2.2 IFX不應(yīng)答自噬相關(guān)標(biāo)志物的篩選將數(shù)據(jù)集GSE78068和GSE58795中差異基因與自噬參考基因集取交集，得到16個(gè)基因（圖2A）。在數(shù)據(jù)集GSE78068中，使用單因素Logistic回歸分析該16個(gè)基因與IFX不應(yīng)答間的關(guān)系，結(jié)果顯示16個(gè)基因均與IFX不應(yīng)答相關(guān)（表1）。為降低數(shù)據(jù)維度，以及避免變量間的多重共線性，在訓(xùn)練集GSE78068中使用Lasso回歸對(duì)變量進(jìn)行進(jìn)一步篩選。Lasso回歸結(jié)果顯示，當(dāng)lambda.min取值0.025（loglambda.min=?3.700）時(shí)，共篩選出6個(gè)系數(shù)不為0的基因：

表1 單因素Logistic回歸分析結(jié)果Tab.1 The result of univariate Logistic regression

CHMP2B(charged multivesicular body protein 2B)、ATG4B(autophagy related 4 homolog B)、TFEB(tran?scription factor EB)、SQSTM1(sequestosome 1)、HGS(hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)、NLRC4(NLR family CARD domain con?taining 4)（圖2B、圖2C）。進(jìn)一步使用逐步回歸法在訓(xùn)練集GSE78068中對(duì)該6個(gè)基因與IFX不應(yīng)答間關(guān)系進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，最終篩選出HGS和ATG4B作為IFX治療RA不應(yīng)答的自噬相關(guān)標(biāo)志物。以GSE78068為訓(xùn)練集，使用HGS和ATG4B構(gòu)建IFX治療RA不應(yīng)答預(yù)測(cè)模型，在內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE78068中，AUC=0.708（P<0.05），在外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集GSE58795中，AUC=0.719（P<0.05），表明由HGS和ATG4B構(gòu)建的IFX不應(yīng)答預(yù)測(cè)模型具有較好的區(qū)分能力（圖3）。

圖2 IFX不應(yīng)答自噬相關(guān)標(biāo)志物的篩選Fig.2 Screening of autophagy-related markers in IFX non-responders

圖3 自噬相關(guān)標(biāo)志物診斷價(jià)值分析Fig.3 The diagnostic value analysis of characteristic autophagy related genes

2.3 HGS在IFX不應(yīng)答者外周血白細(xì)胞中表達(dá)升高按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)，共收集到5例不應(yīng)答者和9例應(yīng)答者，納入患者的一般基線資料見表2。提取對(duì)應(yīng)患者治療前外周血白細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用Real-time PCR檢測(cè)HGS在應(yīng)答組和不應(yīng)答組間的表達(dá)。HGS上游引物：CTCCTGTTG?GAGACAGATTGGG，下游引物：GTGTGGGTTCTT?GTCGTTGAC；內(nèi)參GAPDH上游引物：ACAACTTT?GGTATCGTGGAAGG，下 游 引 物：GCCATCACGC?CACAGTTTC。結(jié)果顯示，HGS在不應(yīng)答組患者外周血白細(xì)胞中高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

圖4 HGS在IFX不應(yīng)答者外周血白細(xì)胞中mRNA表達(dá)升高Fig.4 The expression of HGS was increased in peripheral blood leukocytes of IFX non-responders

表2 納入的RA患者IFX治療前一般基線資料Tab.2 Baseline demographic and clinical characteristics of in?cluded RA patients before IFX treatment

2.4 HGS促進(jìn)MH7A細(xì)胞自噬滑膜的慢性炎性增生是RA最特征性的病理改變。研究發(fā)現(xiàn)，增生的滑膜細(xì)胞主要為RA成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA fibro?blast-like synoviocytes,RA-FLS），RA-FLS在RA病理機(jī)制中起著核心作用。因此，本研究檢測(cè)了HGS對(duì)RA滑膜細(xì)胞自噬的影響。將HGS高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)人類滑膜細(xì)胞系MH 7A細(xì)胞，48 h后檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B及P62，結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3BII/LC3BI增加，P62表達(dá)降低，表明HGS促進(jìn)MH7A細(xì)胞自噬（圖5）。

圖5 HGS促進(jìn)MH7A細(xì)胞自噬Fig.5 HGS promoted autophagy in MH 7A cells

3 討 論

本文通過對(duì)比分析IFX治療RA應(yīng)答者與不應(yīng)答者間自噬相關(guān)基因表達(dá)差異，使用單因素Logistic回歸、Lasso回歸、多因素Logistic回歸及ROC分析，最終篩選出與IFX治療RA不應(yīng)答相關(guān)的自噬標(biāo)志物HGS和ATG4B。Real-time PCR結(jié)果顯示，HGS在IFX不應(yīng)答RA患者外周血白細(xì)胞中表達(dá)增多，高表達(dá)HGS后，人類滑膜細(xì)胞系MH 7A細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

近年來，隨著對(duì)RA病理機(jī)制研究的深入，與之對(duì)應(yīng)的治療方式也取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，如新型靶向藥物TNF-α單抗、IL-6受體單抗及IL-1受體拮抗劑等[12]。但是到目前為止，RA病理機(jī)制仍不清楚，尚缺乏徹底治愈RA的方法[1]。TNF-α抑制劑是RA中使用較多的生物制劑，主要包括IFX、ADA及ETN等，TNF-α抑制劑聯(lián)合MTX已廣泛應(yīng)用于RA臨床治療[6]。但是在臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，部分RA患者對(duì)TNF-α抑制劑原發(fā)性或繼發(fā)性不應(yīng)答，其不應(yīng)答機(jī)制尚不清楚。IFX主要應(yīng)用于RA、銀屑病、強(qiáng)直性脊柱炎、潰瘍性結(jié)腸炎及克羅恩病等免疫炎性疾病[5]。研究發(fā)現(xiàn)，IFX在治療上述疾病過程中均存在不應(yīng)答現(xiàn)象，其治療潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病等炎性腸病原發(fā)性不應(yīng)答可能與影響患者體內(nèi)藥物代謝以及影響非TNF-α介導(dǎo)的炎癥過程有關(guān)，但其具體機(jī)制尚不清楚[13-14]。此外，IFX屬于人/鼠嵌合型單克隆抗體，具有一定的免疫原性，體內(nèi)注射可使機(jī)體產(chǎn)生抗IFX抗體（antibodies to infliximab,ATI），其可與IFX特異性結(jié)合，一方面可抑制IFX生物活性，直接影響IFX療效，另一方面二者形成的免疫復(fù)合物可促進(jìn)體內(nèi)IFX清除，間接影響IFX療效[15]。研究發(fā)現(xiàn)，ATI是克羅恩病患者對(duì)IFX不應(yīng)答的主要原因之一[16]。目前，IFX在RA中不應(yīng)答的分子機(jī)制尚無相關(guān)研究。

自噬是細(xì)胞內(nèi)一種重要的自我更新生物學(xué)過程，其通過降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白、損傷老化的細(xì)胞器，維持細(xì)胞的正常新陳代謝，自噬的增強(qiáng)可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞自噬后，抗腫瘤藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，表明自噬可能與抗腫瘤藥耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)[9,17]。IFX與細(xì)胞自噬也密切相關(guān)，在視網(wǎng)膜脫落小鼠模型中，提前注射IFX抑制體內(nèi)TNF-α可增強(qiáng)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞自噬，感光細(xì)胞凋亡減少，表明IFX誘導(dǎo)的自噬可抑制感光細(xì)胞凋亡[18]。自噬是否與IFX治療RA不應(yīng)答相關(guān)尚無相關(guān)研究。XU等[10]在研究MTX治療RA敏感性降低的機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，MTX可誘導(dǎo)RA-FLS自噬增強(qiáng)，抑制自噬后MTX誘導(dǎo)RA-FLS凋亡增加，細(xì)胞增殖速度減慢，表明增強(qiáng)的自噬降低了MTX治療RA敏感性。基于上述研究，推測(cè)IFX治療RA不應(yīng)答可能與患者細(xì)胞自噬水平升高有關(guān)。本研究通過分析IFX治療RA應(yīng)答者與不應(yīng)答者間差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，部分自噬相關(guān)基因在兩組患者中差異表達(dá)，且GSEA分析發(fā)現(xiàn)自噬基因集也主要高表達(dá)于不應(yīng)答組。

為進(jìn)一步探索IFX治療RA不應(yīng)答與自噬相關(guān)基因間的關(guān)系，本研究首先篩選了特征自噬標(biāo)志物，用以預(yù)測(cè)RA患者是否對(duì)IFX不應(yīng)答，同時(shí)也為后續(xù)機(jī)制研究提供靶點(diǎn)。使用單因素Logistic回歸、Lasso回歸以及多因素Logistic回歸分析，最終篩選出HGS和ATG4B作為IFX治療RA不應(yīng)答的特征自噬標(biāo)志物，ROC分析結(jié)果表明使用該特征標(biāo)志物構(gòu)建的預(yù)測(cè)模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。ATG4B是自噬過程中的核心成員，其與自噬體膜延伸、閉合及自噬的成熟均有關(guān)，其在自噬發(fā)生過程中的作用及機(jī)制研究較為透徹[19]。HGS是內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物0（endosomal sorting complex required for transport-0,ESCRT-0）的重要組成部分[20]。ESCRT與調(diào)節(jié)多囊泡體形成和分選、細(xì)胞自噬、囊泡胞吐、mRNA沉默等相關(guān)，在腫瘤及退變性病變過程中發(fā)揮重要作用[20-22]。通過對(duì)比分析HGS在IFX應(yīng)答組與不應(yīng)答組外周血白細(xì)胞中表達(dá)發(fā)現(xiàn)，HGS在不應(yīng)答組內(nèi)表達(dá)升高，推測(cè)其可能在IFX治療RA不應(yīng)答過程中發(fā)揮作用。RA-FLS在RA關(guān)節(jié)炎癥及破壞過程中起著核心作用[23]，且RA-FLS自噬的增強(qiáng)也與MTX治療RA耐藥相關(guān)[10]。因此，本研究進(jìn)一步探索了HGS對(duì)RA-FLS自噬的影響。使用HGS高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人類滑膜細(xì)胞系MH 7A細(xì)胞，結(jié)果顯示HGS可促進(jìn)MH7A細(xì)胞自噬增強(qiáng)。這些結(jié)果初步表明，IFX治療RA不應(yīng)答可能與患者細(xì)胞自噬水平升高有關(guān)。

本研究從自噬角度出發(fā)，通過對(duì)比分析IFX治療RA不應(yīng)答者與應(yīng)答者間的差異表達(dá)自噬相關(guān)基因，使用多種方法篩選出特征自噬標(biāo)志物ATG4B和HGS作為預(yù)測(cè)IFX不應(yīng)答的特征變量，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索HGS對(duì)滑膜細(xì)胞系MH7A細(xì)胞自噬的影響，為IFX治療RA不應(yīng)答的分子機(jī)制研究提供新的方向。在后續(xù)研究中，本課題組擬收集更大樣本的IFX治療RA數(shù)據(jù)，檢測(cè)患者外周血及滑膜組織中ATG4B和HGS表達(dá)，并在原代RA-FLS和RA動(dòng)物模型中研究HGS對(duì)自噬的影響，以及HGS參與IFX治療RA不應(yīng)答的具體分子機(jī)制。