劉 波，芮 雪，方 翟，黃 飛，陶維昆，趙建清，李宏健，高慶華,3*

（1.新疆塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；4.新疆烏魯木齊畜牧獸醫(yī)總站，新疆烏魯木齊 830000）

多浪羊有較高的繁殖能力，性成熟早，且為常年發(fā)情，一般兩年產(chǎn)三胎，而且雙羔率較高，繁殖成活率在220%左右；卡拉庫(kù)爾羊繁殖率較低，一般發(fā)情受季節(jié)影響，產(chǎn)羔率在110%左右[1]。生殖激素受體基因是影響繁殖率的因素之一，促卵泡素受體（FSHR）基因介導(dǎo)促卵泡激素（FSH）作用于卵巢，是卵泡發(fā)育、成熟以及最終引發(fā)排卵的必需物質(zhì)[2]。研究FSHR基因如何加快卵泡的生長(zhǎng)分化、促進(jìn)優(yōu)勢(shì)卵泡的形成以及提高低繁殖家畜的繁殖率具有重要意義。王惠娥等[3]研究多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊卵巢FSHR基因發(fā)現(xiàn)多浪羊?qū)SH的敏感性高于卡拉庫(kù)爾羊，表明FSHR 含量越高繁殖率越高。早期的研究表明缺乏FSH 或FSH 受體的卵泡未能進(jìn)展到排卵前階段，導(dǎo)致不孕[4]。目前認(rèn)為，F(xiàn)SHR基因的組織特異性表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子的作用、DNA 甲基化、染色體的重建、染色體組蛋白的修飾及mRNA、蛋白的轉(zhuǎn)換有關(guān)[5]，其中DNA 甲基化對(duì)基因表達(dá)水平的調(diào)控尤其受到關(guān)注。Priya 等[6]對(duì)大鼠FSHR基因啟動(dòng)子研究中觀察到了FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化帶，且研究DNA 甲基化可能有助于更好地理解綿羊生殖能力的表觀遺傳調(diào)控。DNA 甲基化是調(diào)節(jié)FSHR基因細(xì)胞特異性沉默的主要因素之一，但是目前DNA 甲基化與FSHR基因表達(dá)的研究尚處于早期，還不完全了解其調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)亞硫酸氫鹽測(cè)序（Bisulfite Genomic se-quencing PCR，BSP）技術(shù)檢測(cè)不同綿羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平差異來(lái)探究綿羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平與繁殖性狀的關(guān)系，為進(jìn)一步研究綿羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)DNA 甲基化水平與FSHR基因表達(dá)量的關(guān)系提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血液/ 組織/ 細(xì)胞基因組提取試劑盒（DP304）、RNaseA（100 mg/mL）溶液（RT405-12）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（CB101）、紅細(xì)胞裂解液（RT122）、10×Loading Buffer、DL 2000（8000）Marker 分子量標(biāo)記、快捷性瓊脂凝膠DNA 回收試劑盒、pMD19-T 載體、Hot Start Taq 聚合酶、瓊脂、瓊脂糖、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、無(wú)水乙醇等均購(gòu)自天根生化科技有限公司。甲基化處理試劑盒（D5005）購(gòu)置于ZYMO RESEARCH 公司。

1.1.2 主要儀器 PCR 儀（BIO RAD，C100）；核酸濃度檢測(cè)儀（Thermo，ND-One）；-80℃超低溫冰箱（Thermo，ExF24086V）；低溫高速冷凍離心機(jī)（Sigma，3K30）；高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY，SX-500）；超凈工作臺(tái)（Boxum，SHC-CT-22）；恒溫水浴鍋（上海博訊，HHS-21-4）；電泳儀；凝膠成像儀。

1.1.3 試劑配制 試劑配制均以滅菌蒸餾水為溶劑，高壓滅菌條件：高壓蒸汽滅菌30 min。其余參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版李載平等[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 本實(shí)驗(yàn)使用的動(dòng)物分別為多浪羊和卡拉庫(kù)爾母羊各3 只，均為1 歲母羊，且同品種間無(wú)血緣關(guān)系。血液采自塔里木大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)站，使用一次性采集容器（EDTA-K2）靜脈采血后送回實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 的提取與檢測(cè) 使用試劑盒DP304按照步驟提取不同綿羊血液組織基因組DNA。提取前所用器具高溫高壓滅菌并做烘干處理；使用DNA 提取試劑盒時(shí)，應(yīng)該按照使用說(shuō)明提取DNA；提取完成后使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)質(zhì)量，使用凝膠成像儀觀察基因組DNA 的片段大小及亮度情況，使用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)提取的綿羊血液組織DNA 濃度和純度，并拍照記錄。

1.2.3 基因啟動(dòng)區(qū)引物設(shè)計(jì)合成與預(yù)測(cè) 參考綿羊FSHR基因序列（Gene ID：443299），根據(jù)FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)，使用MethPrimer 在線網(wǎng)站（www.bioon.com.cn/sub/showarticle.asp）預(yù)測(cè)FSHR基因啟動(dòng)子序列存在的CpG 島檢測(cè)區(qū)域是否符合實(shí)驗(yàn)要求，根據(jù)符合要求的區(qū)域設(shè)計(jì)FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)的引物，上游引物：5'-GTGTTTTTGTTTGGAGAATTTTAGG-3'，下游引物：5'-TCAATCAAAAAACCATCTACTTTCA-3'，送往廣州伯信生物科技有限公司進(jìn)行合成。

1.2.4 基因啟動(dòng)子區(qū)的擴(kuò)增及回收純化 以BSP 處理后的綿羊血液DNA 為模板，對(duì)FSHR基因設(shè)置最佳PCR擴(kuò)增體系，PCR 擴(kuò)增程序設(shè)置為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，68～53℃退火，每個(gè)循環(huán)降3℃，10 個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次；72℃終延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆谩U(kuò)增完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，舍棄擴(kuò)增失敗引物，并拍照做好記錄。按瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行產(chǎn)物回收純化。

1.2.5 T-A 克隆及熱激轉(zhuǎn)化 將綿羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)PCR 擴(kuò)增后回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，加DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選。

1.2.6 陽(yáng)性克隆鑒定 過(guò)夜培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生藍(lán)白色菌斑。吸取1 mL 的LB 液體培養(yǎng)基加入到1.5 mL 離心管內(nèi)，用滅菌處理過(guò)的牙簽或者槍頭挑取飽滿的白色菌落放于離心管中，放置于恒溫?fù)u床（37℃，200 rpm）中振蕩培養(yǎng)8 h 左右。參照DNA 模板PCR 擴(kuò)增體系將DNA模板換成菌液進(jìn)行PCR 鑒定，2%凝膠電泳檢測(cè)，挑選優(yōu)質(zhì)（單一清晰，片段大小與目的片段一致的條帶）對(duì)應(yīng)菌液送至測(cè)序。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 CpG 位點(diǎn)的甲基化水平=各CpG 位點(diǎn)的甲基化/ 克隆數(shù)；應(yīng)用QUMA（http://quma.cdb.riken.jp/）在線軟件分析克隆測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpG 島在線預(yù)測(cè) 預(yù)測(cè)結(jié)果為：CpG 島長(zhǎng)度>100 bp，GC 含量>50%，期望值>0.6，檢測(cè)區(qū)域符合實(shí)驗(yàn)要求，預(yù)測(cè)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 FSHR 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG 島預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 基因組DNA 的提取 利用基因組提取試劑盒按照操作步驟提取基因組DNA，使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳以及核酸濃度檢測(cè)儀分別檢測(cè)其濃度、純度。提取的基因組DNA 濃度均可達(dá)到200 ng/μL 以上，OD260/OD280值均在1.8～2.0 之間。因此，提取的血液組織基因組DNA 質(zhì)量較好，滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 綿羊基因組DNA

2.3 基因組DNA 甲基化BSP 擴(kuò)增 分別以重亞硫酸鹽修飾處理過(guò)的多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊血液組織基因組DNA 為模板，對(duì)FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行BSP-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為189 bp，擴(kuò)增片段大小均與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符（圖3）。

圖3 BSP 處理后FSHR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 DNA 甲基化BSP 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收 對(duì)FSHR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，回收純化的DNA 產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為189 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖4）。

圖4 純化后FSHR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.5 DNA 甲基化BSP 克隆 回收純化的DNA 片段分別進(jìn)行TA 克隆和菌液PCR 檢測(cè)，菌液PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，片段長(zhǎng)度都為189 bp（圖5），表明重組克隆載體pGM-T 構(gòu)建成功。

圖5 重組克隆載體菌液PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.6 測(cè)序結(jié)果及分析 如圖6 所示，非甲基化位點(diǎn)中的非甲基化的“C”均轉(zhuǎn)化為“T”，而其余堿基完全一致。

圖6 DNAMAN 序列比對(duì)結(jié)果

運(yùn)用QUMA 在線網(wǎng)站（http://quma.cdb.riken.jp/）對(duì)6 個(gè)測(cè)序序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，目的片段中的4 個(gè)位點(diǎn)為甲基化位點(diǎn)，如圖7 所示，多浪羊中28、49、71位點(diǎn)均不發(fā)生甲基化，61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化。卡拉庫(kù)爾羊中1-3、1-4 羊在28、71 位點(diǎn)不發(fā)生甲基化，在49、61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化。1-5 號(hào)卡拉庫(kù)爾羊在28 位點(diǎn)不發(fā)生甲基化，而在49、61、71 位點(diǎn)均發(fā)生甲基化（圖7）。

圖7 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

由圖8 可知，多浪羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)中的目的序列甲基化位點(diǎn)低于卡拉庫(kù)爾羊。

圖8 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

如圖9 所示，多浪羊組與卡拉庫(kù)爾羊組FSHR基因在啟動(dòng)子區(qū)目的片段中的28 位點(diǎn)都不發(fā)生甲基化；在49 位點(diǎn)只有卡拉庫(kù)爾羊發(fā)生甲基化，甲基化率100%，而多浪羊組不發(fā)生甲基化；61 位點(diǎn)多浪羊組與卡拉庫(kù)爾羊組全部發(fā)生甲基化，甲基化率100%；71 位點(diǎn)只有卡拉庫(kù)爾羊發(fā)生甲基化，甲基化率33.3%，多浪羊組的平均甲基化率為25.0%，卡拉庫(kù)爾羊組的平均甲基化率為58.3%。

圖9 甲基化位點(diǎn)QUMA 分析結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DNA 甲基化檢測(cè)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”BSP檢測(cè)了多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，結(jié)果顯示在多浪羊和卡拉庫(kù)爾羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)目的片段中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)甲基化位點(diǎn)，且多浪羊甲基化發(fā)生率顯著低于卡拉庫(kù)爾羊，推測(cè)在多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊中FSHR基因表達(dá)與DNA 甲基化水平及甲基化位點(diǎn)具有一定的相關(guān)性。

研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中，DNA 甲基化模式似乎在分化和分化細(xì)胞的基因調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用[8]。DNA 甲基化通過(guò)圖式和數(shù)量的改變對(duì)生物信息學(xué)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用[9]。基因啟動(dòng)子區(qū)及附近區(qū)域CpG 島的甲基化是許多基因完成表達(dá)與沉默的調(diào)控方式，通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)CpG 島甲基化狀態(tài)檢測(cè)來(lái)反映出基因表達(dá)情況。通過(guò)對(duì)大鼠FSHR基因的核心啟動(dòng)子區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，7 個(gè)CpG 二核苷酸位點(diǎn)與小鼠FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)的4 個(gè)CpG 二核苷酸位點(diǎn)，經(jīng)BSP 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)FSHR的大鼠/小鼠細(xì)胞中這些潛在甲基化位點(diǎn)均未被甲基化，而在不表達(dá)FSHR的大鼠/ 小鼠的組織細(xì)胞中這些位點(diǎn)的CpG 二核苷酸均被甲基化[10]。盡管大鼠/ 小鼠FSHR啟動(dòng)子中CpG 二核苷酸并不豐富，但啟動(dòng)子中非特定位點(diǎn)的DNA 甲基化與基因失活相關(guān)，DNA 甲基化在大鼠/ 小鼠FSHR基因的調(diào)節(jié)過(guò)程中起著主要作用[11]。蔣曹德等[12]利用甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)技術(shù)（MSAP）分析了甲基化與生長(zhǎng)性狀的關(guān)系，在檢測(cè)到的1 274 個(gè)甲基化位點(diǎn)中，有252 個(gè)多態(tài)性甲基化位點(diǎn)，其中有81 個(gè)位點(diǎn)對(duì)1 個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)性狀有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)在綿羊血液FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)目的片段中找到4 個(gè)甲基化潛在位點(diǎn)，其中在多浪羊組中只有在61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化，而卡拉庫(kù)爾羊組中分別在49、61 位點(diǎn)發(fā)生甲基化，71 位點(diǎn)部分卡拉庫(kù)爾羊發(fā)生甲基化，推測(cè)在不同位點(diǎn)發(fā)生甲基化可能對(duì)FSHR基因的表達(dá)與繁殖力具有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)，源自睪丸腫瘤的小鼠睪丸支持細(xì)胞株（MSC-1）具有非活性的FSHR啟動(dòng)子[13]，并且MSC-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的非活性狀態(tài)與FSHR基因核心啟動(dòng)子的胞嘧啶甲基化相關(guān)[14]。張燕麗等[15]對(duì)綿羊卵巢與多產(chǎn)性相關(guān)的DNA甲基化譜進(jìn)行全基因組分析，發(fā)現(xiàn)一些與激素功能相關(guān)的差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因，如FSHR和FST，高繁殖力群體組與低繁殖力群體組相比卵巢組織中的甲基化水平（FSHR和FST上調(diào)，LHCGR下調(diào)）有顯著差異，這可能會(huì)影響這些基因的mRNA 表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在高繁殖力的多浪羊與低繁殖力的卡拉庫(kù)爾羊中FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)的目的片段中49 位點(diǎn)差異極顯著，這可能是影響FSHR基因表達(dá)量的因素之一，這一甲基化位點(diǎn)與FSHR基因的表達(dá)量是否相關(guān)還需進(jìn)一步研究。

研究表明，基因的啟動(dòng)子區(qū)域和外顯子的低甲基化和高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即甲基化密度高抑制基因表達(dá)，密度低促進(jìn)基因表達(dá)[16]。梁慧慧等[17]對(duì)綿羊下丘腦GNAQ基因研究發(fā)現(xiàn)適量的葉酸濃度使DNMT1基因表達(dá)上調(diào)，GNAQ啟動(dòng)子區(qū)CpG 位點(diǎn)甲基化水平上調(diào)，引起GNAQ表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而間接調(diào)控了GnRH的分泌。羅榮松等[18]對(duì)奶綿羊與蒙古羊全基因組DNA 甲基化研究中發(fā)現(xiàn)，奶綿羊和蒙古羊肌肉和尾脂組織具有一致的DNA 甲基化動(dòng)態(tài)；尾脂組織的甲基化水平高于肌肉組織。啟動(dòng)子區(qū)的GC 含量從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)向側(cè)翼區(qū)域逐漸降低隨后趨于穩(wěn)定，并與DNA 甲基化水平呈負(fù)相關(guān)，GC 含量越高甲基化水平越低。王小莉等[19]通過(guò)對(duì)大鼠不同細(xì)胞的研究，得到大鼠胰島和INS-1細(xì)胞中INS-1基因高表達(dá)，啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度非常低，然而在大鼠其他組織和WB 細(xì)胞中INS-1基因不表達(dá)，啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度很高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為在卡拉庫(kù)爾羊血液中FSHR基因甲基化水平顯著高于多浪羊，而基因的甲基化一般對(duì)基因的表達(dá)量有負(fù)調(diào)控作用，推測(cè)多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊DNA 甲基化水平可能與FSHR基因的表達(dá)呈一定負(fù)相關(guān)。FSHR基因的DNA 甲基化水平及位點(diǎn)差異可能是影響繁殖力的重要因素之一，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究FSHR基因在綿羊卵巢中的表達(dá)與DNA 甲基化水平的關(guān)系提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

多浪羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)中目的片段平均甲基化水平為25%，卡拉庫(kù)爾羊FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)目的片段平均甲基化水平為58.3%，多浪羊與卡拉庫(kù)爾羊在目的片段CpG 島上49 號(hào)位點(diǎn)甲基化水平差異較大，2 個(gè)品種間FSHR基因啟動(dòng)子區(qū)目的片段DNA 甲基化水平差異顯著，推測(cè)FSHR基因甲基化水平與綿羊FSHR基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。