張麗娟，藍(lán)獻(xiàn)泉，鄭錦坤，闕偉祺，李慶德，朱 燕

（1.粵北人民醫(yī)院，廣東 韶關(guān) 512026； 2.廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 韶關(guān) 512028）

鼻咽清顆粒為粵北人民醫(yī)院的特色制劑（粵藥制字Z20071539），由重樓、夏枯草、野菊花、龍膽、兩面針、蛇泡勒、太子參、蒼耳子8味中藥組方，用于治療鼻咽部慢性炎癥及鼻咽癌放射治療后分泌物增多，可抑制鼻咽癌的生長(zhǎng)，且具有放療增敏作用[1]。方中龍膽具有清熱燥濕、瀉肝膽火等功效，有效成分為龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷等環(huán)烯醚萜苷類化合物。龍膽苦苷具有良好的抗氧化應(yīng)激、抗肝損傷、抗腫瘤等藥理作用[2-3]，含量高，與龍膽藥材藥理作用一致，常作為評(píng)價(jià)龍膽藥材質(zhì)量的重要指標(biāo)。夏枯草性寒，味辛、苦，歸肝膽經(jīng)，善清肝火、散郁結(jié)，主要活性成分迷迭香酸為典型的酚酸類物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性[4-5]。野菊花清熱解毒，主要活性成分蒙花苷具有抗炎、免疫、保肝、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用[6]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為夏枯草和兩面針的薄層鑒別，未對(duì)組方成分進(jìn)行含量測(cè)定，不利于質(zhì)量控制。本研究中參考文獻(xiàn)[7-13]，采用反相高效液相色譜雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定鼻咽清顆粒中龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷3種活性成分的含量，并確定其含量限度，為進(jìn)一步完善該制劑的標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MSA225S-ICE-DU型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，精度為十萬(wàn)分之一）；AS10200ADT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為300W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

鼻咽清顆粒（粵北人民醫(yī)院醫(yī)院制劑，批號(hào)分別為20190325，20191227，20200520）；龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)為110770-201918，含量以97.1%計(jì)），迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)為111871-201706，含量以90.05%計(jì)），蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)為111528-201509，含量以97.50%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。龍膽（批號(hào)為20200524），兩面針（批號(hào)為15042806），野菊花（批號(hào)為20200501），蒼耳子（批號(hào)為20180603），均購(gòu)自湖南安健中藥飲片有限責(zé)任公司；重樓（樟樹(shù)市慶仁中藥飲片有限公司，批號(hào)為1406248）；夏枯草（安徽鑫泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)為200701）；蛇泡勒（廣州至信中藥飲片有限公司，批號(hào)為200401）；太子參（江西致和堂中藥飲片有限公司，批號(hào)為200701）；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：ACE Excel C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min時(shí)10%A，5～10 min時(shí)10%A→15%A，10～13 min時(shí)15%A，13～18 min時(shí)15%A→22%A，18～20 min時(shí)22%A，20～30 min時(shí)22%A→30%A，30～40 min時(shí)30%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm（0～20 min時(shí)龍膽苦苷），334 nm（20～40 min時(shí)迷迭香酸和蒙花苷）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。各組分與相鄰峰之間分離度均大于1.5，龍膽苦苷、迷迭香酸、蒙花苷的理論板數(shù)均不低于10 000。

2.2 溶液制備

取龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.529 2，0.100 3，0.227 8 mg/mL的混合對(duì)照品貯備液；分別精密量取上述對(duì)照品貯備液0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL，置25mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲處理30 min后取出，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得供試品溶液。按處方比例及工藝分別制備不含龍膽、夏枯草和野菊花的陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果龍膽、夏枯草和野菊花陰性對(duì)照品溶液均無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷的線性回歸方程分別為Y龍=14131X龍+4349（r=1.0000，n=6），Y迷=83 851X迷-18 242（r=0.999 7，n=6），Y蒙=24 770X蒙-999（r=1.000 0，n=6）。結(jié)果表明，龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷質(zhì)量濃度分別在5.29～169.34μg/mL，1.00～32.09μg/mL，2.28～72.88μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積基本不變，RSD分別為0.06%，0.22%，0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20191227）樣品2 g，精密稱定，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的RSD分別為0.87%，1.10%，1.43%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20191227）樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，16，24 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.25%，0.26%，0.39%（n=7），表明供試品溶液在常溫下放置24 h穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20191227）1 g，精密稱定，共9份，分別精密加入混合對(duì)照品貯備液0.25，0.40，0.55 mL，各3份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20190325，20191227，20200520）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.2 Content determination of gentiopicroside，rosmarinic acid and buddleoside in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

中成藥多為復(fù)方制劑，成分多且復(fù)雜，單一波長(zhǎng)有時(shí)無(wú)法同時(shí)檢測(cè)多種組分。故采用雙波長(zhǎng)切換法可極大地提高檢測(cè)效率。分別配制含龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷質(zhì)量濃度為20μg/mL的對(duì)照品溶液和供試品溶液，用二極管陣列檢測(cè)器于200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果顯示，迷迭香酸、蒙花苷、龍膽苦苷分別在330，334，274 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，但龍膽苦苷于330 nm波長(zhǎng)附近幾乎無(wú)吸收。故選定274 nm（0～20 min）和334 nm（21～40 min）作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相選擇

曾考察甲醇-水、乙腈-0.1%三氟乙酸、乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫。結(jié)果采用甲醇-水流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，迷迭香酸不出峰；采用乙腈-0.1%三氟乙酸和乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)時(shí)，3種目標(biāo)組分的分離效果均良好，峰形尖銳且對(duì)稱，定量結(jié)果準(zhǔn)確?？紤]三氟乙酸具有輕微的毒性，故采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 提取條件選擇

分別考察以100%，75%，50%甲醇作為溶劑時(shí)對(duì)鼻咽清顆粒中3種成分的提取效果。結(jié)果表明，100%甲醇時(shí)蒙花苷提取效果明顯優(yōu)于另外2種溶劑，而龍膽苦苷和迷迭香酸則無(wú)明顯差異，故選擇甲醇作為提取溶劑。確定提取溶劑后，分別考察超聲處理15，30，60 min和加熱回流30，60，90 min的提取效果。結(jié)果表明，超聲處理30 min和加熱回流60 min對(duì)3種有效成分基本提取完全，數(shù)據(jù)無(wú)明顯差異?？紤]超聲操作簡(jiǎn)易方便，故選定超聲處理30 min。

3.4 含量限度確定

方中龍膽、夏枯草和野菊花均收載于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》[14]，含量測(cè)定指標(biāo)成分分別為龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷，按照藥典規(guī)定的含量測(cè)定方法對(duì)這3味藥材進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均大于藥典規(guī)定的限值。根據(jù)公式[轉(zhuǎn)移率（%）=成藥中被測(cè)物質(zhì)的含量/（藥材被測(cè)物質(zhì)的含量×處方量）×100%]分別計(jì)算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果龍膽苦苷、迷迭香酸、蒙花苷的轉(zhuǎn)移率分別為32.16%～51.16%，33.43%～43.85%，26.25%～45.47%?？紤]藥材質(zhì)量及工藝提取率，暫將限度定為2015年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定藥材含量的限值×處方量×平均轉(zhuǎn)移率，最終將鼻咽清顆粒中龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的限度定為0.200，0.024，0.043 mg/g。為了確保限值制訂的合理性，以后將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量研究。

3.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

本研究中建立了同時(shí)測(cè)定樣品中龍膽苦苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的雙波長(zhǎng)反相高效液相色譜法，能有效定量控制其中的活性成分，且該方法前處理簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可用于鼻咽清顆粒的質(zhì)量控制。