閔筱輝?覃延翔?黎潔瑤?陳其奎?蕭煥明?許稷豪

【摘要】目的 探討四君子湯改善肝硬化病理改變的作用，并且研究四君子湯對肝細胞的轉錄組學改變情況，探索潛在的分子作用機制。方法 采用四氯化碳（CCl4）誘導大鼠產生肝硬化，并用標準劑量的四君子湯灌胃治療肝硬化大鼠12周，通過肝組織HE染色、Masson染色，從病理學改變評估四君子湯治療肝硬化效果。隨后采取Illumnia高通量測序，同步對轉錄組學測序結果篩選差異表達基因（DEG），并進行生物聚類分析、KEGG信號通路聚類分析。結果 與正常SD大鼠相比，CCl4誘導的肝硬化SD大鼠肝組織出現(xiàn)廣泛的假小葉，轉錄組學測序共篩選出402個DEG。GO富集分析發(fā)現(xiàn)DEG主要富集于細胞周期相關生物學功能。KEGG分析提示DEG明顯富集于細胞增殖、分化通路。CCl4誘導肝硬化大鼠在經過四君子湯治療后，肝臟組織中的假小葉明顯減少，共有411個DEG。GO以及KEGG分析提示DEG分別富集于細胞周期生物學功能以及細胞增殖、腫瘤相關信號通路。結論 四君子湯可有效緩解CCl4所誘導的肝硬化，其中細胞增殖相關Wnt通路受到明顯調控，可能是四君子湯治療肝硬化的分子機制。

【關鍵詞】肝硬化;四君子湯;轉錄組學;細胞增殖

Mechanism of Sijunzi decoction in treatment of liver cirrhosis based on? transcriptomic sequencing

Min Xiaohui， Qin Yanxiang， Li Jieyao， Chen Qikui， Xiao Huanming， Xu Jihao.Department of Gastroenterology， Sun Yat-sen Memorial hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Xu Jihao， E-mail： xujh66@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect and molecular mechanism of Sijunzi decoction on the pathological changes of CCl4-induced liver cirrhosis （LC） and evaluate the role of Sijunzi decoction in the transcriptomic changes of liver cells. Methods SD rats were treated with CCl4 to induce LC and given with standard dose of Sijunzi decoction for 12 weeks by gavage. The efficacy of Sijunzi decoction in the treatment of LC was assessed according to pathological changes by HE and Masson staining. The deferentially-expressed genes （DEGs） in CCl4-induced LC rats were identified using Illumina Hiseq sequencing system. The gene ontology （GO） and pathway enrichment analyses were performed in the DAVID and KEGG pathway databases， respectively. Results Compared with the SD wild-type rats， CCl4-induced LC rats presented with multiple liver fibrous septa and cirrhotic nodules. The treatment of Sijunzi decoction significantly reduced liver fiber interval and degeneration degree in CCl4-induced LC rats. A total of 402 DEGs were identified between the wild-type and CCl4-induced LC rats. GO enrichment analysis demonstrated that the DEGs were mainly enriched in cell cycle-associated biological function. The KEGG pathway enrichment analysis revealed that the DEGs were significantly associated with cell proliferation- and cell division-associated signaling pathways. Similarly， Sijunzi decoction treatment led to 411 DEGs in the liver of LC rats. GO and KEGG analyses revealed that those DEGs were significantly enriched in the cell cycle process and cell proliferation- and tumor-associated signaling pathways， respectively. Conclusion Sijunzi decoction effectively attenuates CCl4-induced LC in rat models by regulating the cell proliferation-associated Wnt signaling pathway， which is probably the underlying mechanism.

【Key words】Liver cirrhosis; Sijunzi decoction; Transcripnomic analysis; Cell proliferation

肝硬化是由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害，主要病因為病毒性肝炎、酒精中毒及營養(yǎng)障礙等。病理改變?yōu)楦渭毎麖V泛壞死、殘存肝細胞代償性再生形成結節(jié)、結締組織增生與纖維隔形成，進一步破壞肝小葉結構，形成假小葉。肝臟逐步變形、變硬，最終形成肝硬化[1-2]。肝硬化可引起多個并發(fā)癥，譬如門靜脈高壓、門靜脈血栓、肝性腦病、肝肺綜合征及肝腎綜合征等[3-5]。肝硬化作為全球第14大死因，每年導致120萬人死亡，儼然已成為嚴重威脅全球的公共健康問題[6]。四君子湯是一種傳統(tǒng)的中藥制劑，由人參、茯苓、白術、甘草炮制而成[7]。在祖國醫(yī)學臨床實踐中，四君子湯主要用于治療慢性胃炎、潰瘍性結腸炎、慢性腹瀉、急慢性肝損傷、腸麻痹及習慣性便秘等諸多消化道疾病[8-10]。有文獻報道四君子湯可有效改善肝臟切除術后的肝功能和免疫功能，減輕肝纖維化水平[11]。有實驗證實四君子湯的應用可以明顯減少大鼠肝臟缺血-再灌注損傷時肝細胞凋亡[12]。上述研究提示四君子湯具有潛在抗肝纖維化、修復肝細胞作用，然而目前仍未有研究分析四君子湯對肝硬化的治療效果及作用機制，因此本研究旨在探索四君子湯對肝硬化的治療作用及其潛在的分子生物學機制。

材料與方法

一、主要試劑和動物

純四氯化碳（CCl4）、純橄欖油購自武漢化學試劑公司，制成10%CCl4橄欖油溶液;制備四君子湯的所有中草藥原材料均來自湖北天脊中草藥切片有限公司，將所有原料（人參、茯苓、白術、甘草，配制比例9∶9∶9∶6）放入陶瓷鍋中，用1500 mL純水浸泡30 mim，大火煮沸后，文火熬制30 mim，隨后用雙層紗布過濾湯劑。過濾后的湯劑濃縮成1.0 g/mL，儲存在4 ℃環(huán)境，使用時在40 ℃后加熱[13]。SD雄性大鼠由中山大學實驗動物中心購入，共16只，6周齡。大鼠飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境維持于（23±3）℃，每12 h晝夜明暗交替。動物實驗過程均嚴格遵守中山大學實驗動物倫理委員會的倫理準則。

二、肝硬化大鼠模型的建立和四君子湯干預

將16只健康雄性 SD大鼠按編號隨機分為H1組（空白對照組，n = 4） 、H2組（干預對照組，n = 4） 、H3組（干預模型組，n = 4）和H4組（空白模型組，n = 4）。采用腹腔注射10% CCl4誘導肝硬化大鼠模型[14]。H3和H4組大鼠腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液，給藥劑量為1 g/μL，每周3次;H2、H4組在腹腔注射后，給予四君子湯[1.5 g /100 （g·d） ]灌胃干預。H1、H2組大鼠腹腔注射等劑量橄欖油溶液后，給予生理鹽水灌胃對照。CCl4造模、四君子湯干預持續(xù)12周。

三、肝組織病理染色

在干預終點，對各組大鼠實施頸椎脫臼法處死。本研究采用肝硬化疾病評分模型 （ SLCD，結果記為R值）及拉埃內克纖維化評分系統(tǒng) （LFSS，LFSS評分中0期為正常肝組織、1 ～ 3期為纖維化期、4A ～ 4C為肝硬化期，L為4B期，可見纖維隔明顯增寬、增多，假小葉的數(shù)量增加，提示肝硬化造模成功）評估小鼠肝硬化造模效果[15-17]。R值計算公式如下（式中W、T、A、P、I、C分別代表大鼠年齡、血清總膽紅素、血清清蛋白、血清前清蛋白、凝血酶原時間國際標準化比值、血清肌酐）：

R = 0.16×（20 - W）/10+0.24×（17.06 - T）/

16.44 + 0.2×（A - 10.33）/11.95 + 0.14×（P - 2.93）/

11.63 + 0.14×（0.92 - I）/0.16 + 0.12×（32.11 - C）/

11 - 61

R = 1表示肝組織正常，0.702≤R < 1表示肝臟炎癥反應和局灶性變性、壞死，0.542≤R < 0.702表示肝組織纖維增生，0.352≤R < 0.542表示肝臟假小葉形成，屬于肝硬化期，R < 0.352表示肝硬化后期。

沿正中線剪開腹腔，充分暴露腹腔后用真空采血管于下腔靜脈采血，標本離心后取上清液上機檢測總膽紅素、清蛋白、前清蛋白、凝血酶原時間國際標準化比值、血清肌酐等，然后將左葉肝組織剪取下，并浸泡于甲醛固定液，按標準步驟制作成石蠟切片。對肝組織進行HE染色。為了分析肝纖維化區(qū)域的網(wǎng)狀纖維，按照標準步驟進行Masson染色[18]。用HE以及Masson染色法，比較各組間的差異。在顯微鏡下（×400）進行肝組織病理觀察，肝小葉的廣泛形成代表肝硬化造模成功。

四、轉錄組學測序

轉錄組學測序的流程主要包括：樣品檢測、文庫構建、文庫質量檢測、上機測序等部分，用 Illumina 高通量測序平臺（HiSeq/MiSeq）進行雙末端測序。隨后按照以下流程進行測序數(shù)據(jù)處理：原始測序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)質量評估及數(shù)據(jù)過濾，參考序列/基因組比對分析，轉錄本組裝。

五、測序數(shù)據(jù)分析

轉錄組學測序所得數(shù)據(jù)進行差異表達基因（DEG）分析，主要包括GO富集分析及KEGG富集分析。分別對轉錄組學測序數(shù)據(jù)使用DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）進行聚類分析，根據(jù)默認參數(shù)來檢索GO和信號通路富集分析[19]。結果只顯示生物過程類別和信號通路中富集程度最高的10個聚類。

六、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以? 表示，多組間樣本比較用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義后，用LSD-t法進行兩兩比較。P < 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、肝硬化造模成功

HE染色提示，H1、H2組大鼠肝組織結構完整，未見變性或壞死細胞，肝小葉結構清晰，見圖1A、B。LSD-t分析提示，H1與H2組R值比較差異無統(tǒng)計學意義，其余各組間R值比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均 < 0.05），見表1。H3組大鼠經過CCl4誘導后，肝小葉結構破壞，纖維組織增生，假小葉形成，SLCD評分R = 0.457±0.010。提示肝硬化造模成功，同時肝細胞大量脂肪變性、壞死、纖維間隔形成，肝細胞增生明顯，間質內彌漫性炎細胞浸潤，見圖1C。H4組經過四君子湯治療12周后，大鼠肝小葉結構因纖維組織分割而紊亂，原肝小葉沒有被完全分割，假小葉數(shù)量較H3組減少，肝細胞形態(tài)與H1組相似（圖1D）。

二、四君子湯對肝硬化的治療效果

Masson 染色顯示，H1、H2組大鼠肝小葉結構完整，未見纖維組織增生（圖1E、F）。CCl4維持誘導下，H3組大鼠肝小葉結構破壞明顯，纖維組織大量增生，并破壞小葉界板，廣泛形成假小葉，纖維隔顯著增寬;經過四君子湯治療后，H4組大鼠受CCl4誘導破壞的肝小葉、纖維化范圍減少，假小葉數(shù)量下降（圖1G、H）。

三、四君子湯干預后轉錄組學分析

根據(jù)FDR≤0.05且|log2FC|≥1作為DEG的篩選條件，結果以火山圖進行展現(xiàn)。在CCl4誘導的肝硬化模型中，共有402個DEG，其中有284個上調，118個下調（H1 vs. H3，圖2A）。通過H4與H3組的對比，分析四君子湯干預肝硬化的作用，共篩選出411個DEG，其中292個上調，119個下調（圖2B）。

依據(jù)4組的基因表達情況，并按照DEG的篩選條件制作4組DEG表達熱點圖（圖3）。熱點圖提示共有15個DEG在H3組明顯高表達;Rgs16、Ac094053以及Cpne4均在H1組呈現(xiàn)特異性高表達;對比于H1、H3組，Bmp4、Ihh、Rtp3和Lpar6 4個基因均在H2與H4組呈現(xiàn)高表達。

四、DEG聚類分析

對上述DEG進行GO聚類注釋、分類以及統(tǒng)計。結果顯示，肝硬化病變過程中，DEG在生物過程分類里顯著富集于細胞周期及細胞分化相關功能;在分子功能分組上，細胞骨架蛋白結合、蛋白激酶活性及結合、微管結合是顯著富集的類型;在細胞組分分組上，微管、細胞骨架、微小染色體維持復合體是顯著富集的類型，見圖4。

肝硬化大鼠在接受四君子湯干預后，肝組織所產生的DEG，同樣也主要富集于細胞周期等相關聚類;而在分子功能聚類中，DEG顯著富集在Wnt蛋白結合、核受體活性及蛋白激酶結合等功能。在細胞組分聚類上，微管、細胞骨架及細胞連接是顯著富集類型，見圖4。

五、KEGG信號通路顯著富集分析

同樣地，本研究對上述篩選所得出的DEG進行KEGG信號通路富集分析，選取富集程度最高的前30個信號通路。結果顯示，CCl4誘導肝硬化 大鼠的肝組織中，DEG主要富集在Wnt、p53、Hippo等細胞增殖、腫瘤相關通路（圖5A）。相類似地，四君子湯干預后，肝硬化大鼠肝組織中的DEG顯著聚集于Wnt、p53以及Hippo等細胞增殖、腫瘤相關信號通路（圖5B）。

討 論

肝硬化是由于病毒感染、自身免疫異常、藥物等因素，造成肝細胞不可逆地破壞，進一步導致肝內假小葉的形成，肝硬化及其并發(fā)癥對患者的生活質量、生存預后的嚴重影響[20-22]?；谖覈嫶蟮母斡不颊呷后w基數(shù)，尋求合理有效的治療方法改善患者預后是目前極為迫切的需求。四君子湯作為傳統(tǒng)的中藥復方制劑，在臨床實踐中被應用于多種消化道疾病治療，也有報道四君子湯可能對肝硬化有潛在的治療作用，但是目前尚未有明確的研究驗證四君子湯對肝硬化的療效，以及其中的分子機制[23-25]。本研究者發(fā)現(xiàn)，在CCl4的作用下，大鼠肝臟組織廣泛出現(xiàn)了典型的肝小葉;而四君子湯能有效減少CCl4誘導的肝假小葉數(shù)量，提示四君子湯對肝硬化具有潛在的治療作用。同時運用轉錄組學測序分析探索四君子湯改善肝硬化的分子生物學機制。

CCl4誘導的肝硬化大鼠肝細胞轉錄組學測序得到的DEG，經過GO聚類分析，證實DEG聚集于細胞周期相關生物過程、細胞骨架蛋白結合、蛋白激酶活性及結合、微管結合等分子功能分組上、微管、細胞骨架、微小染色體維持復合體等細胞組分。GO聚類下3個組分的主要分類主要與細胞周期、細胞增殖相關聯(lián)，細胞周期的有序進行，促進遺傳物質復制、細胞更新以及增殖，肝細胞再生即是在細胞增殖調控因子的作用下，肝細胞進行增殖、分化[26]。大鼠肝硬化病理進展中，有關細胞周期相關功能的基因差異化表達，提示肝細胞在上游調控機制作用下，產生增殖、更新功能異常。四君子湯干預作用下，肝細胞的DEG生物學功能聚類主要聚集在細胞周期、分化功能。這一結果提示，四君子湯可調節(jié)、修復CCl4誘導肝細胞周期、增殖功能異常，從而產生肝硬化治療作用。

既往研究提示p53、Hippo、Wnt等細胞增殖、腫瘤相關信號通路參與肝纖維化的分子調控機制[27-29]。類似地，本研究通過KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)CCl4誘導肝硬化大鼠的肝組織中，Wnt、p53、Hippo多個基因產生差異化表達。四君子湯的干預，Wnt、p53、Hippo信號通路活性產生明顯改變，肝纖維化得到有效的改善。提示四君子湯對這些經典的細胞增殖通路有重要的調控作用。其中，GO分子功能組分分析顯示四君子湯干預可影響Wnt蛋白結合，因此，Wnt可能為四君子湯抗肝纖維化、調節(jié)肝細胞異常增殖、分化的重要靶點。Wnt通路在細胞作為經典的細胞增殖通路，在維持細胞的正常增殖有著重要作用，通路活性的改變可促進肝細胞異常增殖進一步誘發(fā)腫瘤形成[30-32]。

新近研究證實Wnt信號通路的下游靶點CCN4顯著上調肝纖維化標志物的表達，從而促進肝硬化的病理進展，靶向調節(jié)Wnt通路可能是抗肝纖維化的作用靶點[33-34]。本研究結果顯示CCl4誘導的肝硬化組織中Wnt通路多個基因產生差異化表達，而在四君子湯治療后，Wnt通路受到調控，多個DEG顯著聚集于Wnt通路，提示W(wǎng)nt可能在肝硬化病變中起著重要調控作用，而四君子湯改善肝組織纖維化的過程，顯著調節(jié)Wnt通路活性，提示W(wǎng)nt通路可能是四君子湯治療肝硬化的潛在分子生物學機制。

綜上所述，本研究四君子湯對肝硬化大鼠模型干預，證實四君子湯可有效緩解肝硬化進程，可能是作用于Wnt等細胞增殖相關通路，進而調控肝細胞周期、增殖功能，發(fā)揮延緩、改善肝纖維化的作用。該發(fā)現(xiàn)可能為四君子湯治療肝硬化發(fā)生提供實驗依據(jù)、理論基礎和個體化靶點，為進一步研發(fā)傳統(tǒng)中醫(yī)藥制劑精確化治療肝硬化提供重要的實驗依據(jù)。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-06-15）

（本文編輯：楊江瑜）