邵帥，朱清，劉潔

1.荊門市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北 荊門 448000；

2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)科，廣東 廣州 511436；

3.荊門市第二人民醫(yī)院病理科，湖北 荊門 448000

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，影響著全球數(shù)百萬婦女的生活。據(jù)報(bào)道宮頸癌是女性第4常見癌癥，在南非、印度、中國和巴西等中低收入國家尤其常見，2018年宮頸癌新增人數(shù)大約570 000人，死亡約311 000人[1]，84%的新病例以及87%～90%的死亡率發(fā)生在中低收入國家。盡管如此，與發(fā)達(dá)國家的婦女相比，中低收入國家的婦女死于宮頸癌年齡普遍偏低[2-3]。宮頸癌已經(jīng)嚴(yán)重威脅女性的健康和生命，宮頸癌的防治已經(jīng)顯得極其重要。盡管近年來治療技術(shù)不斷改進(jìn)，但手術(shù)、化療以及放療仍有很多的局限性，因此，從機(jī)制上研究宮頸癌的預(yù)防和治療更為迫切。

研究發(fā)現(xiàn)Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路與癌癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)，并且與宮頸癌也存在著關(guān)聯(lián)。Shh信號(hào)通路的上游部分在宮頸癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)，而且在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中Shh信號(hào)通路的激活可以調(diào)節(jié)宮頸癌干細(xì)胞的特性[4]；SGLT2抑制劑也可以通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)Shh表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Cyclopamine抑制Shh通路能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡[6]，但具體機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。近年來有研究顯示二甲雙胍在宮頸癌細(xì)胞中能夠激活A(yù)MPK/p53軸和抑制PI3K/AKT信號(hào)，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡并抑制遷移[7]；miR-214通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響[8]。除此之外，報(bào)道也顯示PI3K/Akt信號(hào)通路通過下調(diào)Shh-Gli1信號(hào)參與抑制SASH1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[9]，Shh信號(hào)通路也可以通過PI3K/AKt信號(hào)通路來調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的凋亡[10]。鑒于Shh、PI3K/AKt信號(hào)通路以及宮頸癌之間的相互作用，因此，本文主要探討Shh信號(hào)通路對宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡作用是否與PI3K/AKt通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌海拉細(xì)胞(Hela)來自廣州醫(yī)科大學(xué)，RPMI-1640培養(yǎng)基、青-鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶來自GIBCO公司(美國)；Purmorphamine來自Santa Cruz公司(美國)；LY294002來自CST公司(美國)；Trizol來自Invitrogen公司(美國)；熒光定量PCR試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNase-free H2O來自大連TaKaRa公司(中國)；MTT檢測試劑盒、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)活性檢測試劑盒來自碧云天公司(中國)；抗體AKt、Bax、P-AKt、Bcl-2來自Abcam公司(英國)；β-acting、HRP-山羊抗兔來自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(中國)。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100 U/mL雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，將接種Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿放于通有5%CO2、37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新的培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長到70%～80%進(jìn)行消化傳代，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 Hela細(xì)胞分組及處理 將1.2.1培養(yǎng)的Hela細(xì)胞消化傳代時(shí)，以1×105/mL接種于含有2 mL培養(yǎng)液6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為對照組、Shh組、Shh+LY294002(LY)組、LY組。Shh組添加2μmol Purmorphamine(Pur)孵育24 h；Shh+LY組經(jīng)Pur處理前半小時(shí)添加20μmol LY294002處理；LY組則添加20μmol LY294002處理孵育；對照組則加入等量的生理鹽水。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 按1.2.2中Hela細(xì)胞分組及處理后，Trizol手提法對各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，提取完畢加入RNase-free水進(jìn)行溶解，通過NanoDrop-1000分光光度計(jì)對RNA純度進(jìn)行檢測(OD260/280為1.8～2.0表示合格)。將合格的RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，添加下表中的Smo、Gli1、β-actin引物擴(kuò)增基因，ABI 7500儀器進(jìn)行檢測7次跨膜蛋白(Smo)、Gli家族鋅指蛋白-1(Gli1)mRNA表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。引物由invitrogen公司合成，見表1。

表1 相關(guān)引物序列

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞抑制率 將Hela細(xì)胞以1×104/的細(xì)胞接種于含有100μL的96孔板中，按1.2.2中Hela細(xì)胞分組及處理后，孔板邊緣用PBS填充，每組6個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入20μL MTT溶液(5μg/mL)，培養(yǎng)4 h后加入DMSO 150μL振蕩15 min，以490 nm波長測定吸光度OD值。

1.2.5 Caspase-3和Caspase-9活性檢測 Hela細(xì)胞按上述1.2.2方法培養(yǎng)和處理細(xì)胞后，去掉培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，每孔加150μL RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞，冰浴裂解30 min，若裂解不充分可通過超聲波震碎，裂解完全后12 000 r/min、4℃條件下離心10 min收集EP管中上清液。根據(jù)檢測試劑盒說明，以405 nm波長測定吸光度OD值。

1.2.6 Western blot檢測B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達(dá) Hela細(xì)胞按上述1.2.2方法培養(yǎng)和處理細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，每孔加150μL RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞，若裂解不充分可通過超聲波震碎，裂解完全后BCA法檢測蛋白濃度，與5×Loading Buffer混合后煮沸10 min，加樣，各組取40μg蛋白樣品于聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后275 mA電流2 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，待蛋白Mark分散開來，根據(jù)Mark蛋白分子指示裁剪相關(guān)PVDF膜，將各PVDF膜分別置于孵育盒中，分別加入對應(yīng)的AKt、P-AKt、Bax、Bcl-2、β-actin抗體(1：1 000)，孵育盒置于4℃冰箱水平搖床上過夜；取出后待孵育盒恢復(fù)到室溫，使用TBST洗滌三遍后，HRP-山羊抗兔抗體室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較均采用ANOVA單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pur對Shh信號(hào)通路的影響 與對照組比較，Shh組能夠明顯增加Shh信號(hào)通路分子Smo和Gli1 mRNA表達(dá)量，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 Pur對Shh信號(hào)通路的表達(dá)影響(±s)

表2 Pur對Shh信號(hào)通路的表達(dá)影響(±s)

組別對照組Shh組t值P值Smo mRNA 1.00±0.098 2.23±0.105-14.836 0.001 Gli1 mRNA 1.00±0.087 1.99±0.041-17.809 0.001

2.2 LY294002對PI3K/AKt信號(hào)通路的影響 與對照組比較，Shh組夠上調(diào)P-AKt表達(dá)量以及P-AKt/AKt比值，LY294002能夠下調(diào)P-AKt表達(dá)量以及P-AKt/AKt比值，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Shh組比較，LY294002能夠抑制Pur的上調(diào)P-AKt表達(dá)量以及P-AKt/AKt比值，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與其他各組比較，LY組P-AKt表達(dá)量以及P-AKt/AKt比值明顯下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1和表3。

圖1 四組AKt、P-AKt蛋白的表達(dá)水平

images/BZ_9_1271_230_2269_264.pngP-AKt/AKt 1.00±0.058 1.66±0.045a 1.34±0.031c 0.77±0.025b 100.725 0.001組別對照組Shh組Shh+LY組LY組F值P值A(chǔ)Kt 1.00±0.053 0.90±0.060 0.98±0.068 1.03±0.042 0.961 0.457 P-AKt 1.00±0.058 1.52±0.045a 1.28±0.031c 0.83±0.025b 91.863 0.001注：與對照組比較，a P<0.01，b P<0.05；與Shh組比較，c P<0.01。

2.3 LY294002對Hela細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，Shh組中Hela細(xì)胞的增殖明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Shh組比較，Shh+LY組中Shh信號(hào)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的增殖明顯受到LY294002抑制，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Control組、Shh組以及Shh+LY組比較，LY組能夠明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 LY294002對Hela細(xì)胞增殖的影響(±s)

表4 LY294002對Hela細(xì)胞增殖的影響(±s)

注：與對照組比較，a P<0.01，b P<0.05；與Shh組比較，c P<0.01。

存活率(%)100±10.1 128±11.1a 113±9.5c 081±8.1b 57.126 0.001組別對照組Shh組Shh+LY組LY組F值P值

2.4 LY294002對Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響 Elisa檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，Shh組激活Shh信號(hào)通路能夠抑制Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Shh組比較，Shh+LY組中抑制PI3K/AKt信號(hào)通路能夠緩解Shh信號(hào)誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9的抑制作用，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對照組比較，LY組能夠促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Shh組和Shh+LY組比較，LY組能夠明顯促進(jìn)Caspase-3和Caspase-9表達(dá)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

表5 LY294002對Caspase-3和Caspase-9表達(dá)的影響(images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s，ng/L)組別對照組Shh組Shh+LY組LY組F值P值Caspase-3 1.00±0.053 0.66±0.060a 0.78±0.068c 1.20±0.042b 91.863 0.001 Caspase-9 1.00±0.058 0.69±0.045a 0.81±0.031c 1.15±0.025b 135.665 0.001images/BZ_9_1271_2970_2113_3004.png

2.5 LY294002對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響 Western Blot檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，Shh組激活Shh信號(hào)通路能夠抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與Shh組比較，Shh+LY組中抑制PI3K/AKt信號(hào)通路能夠緩解Shh信號(hào)誘導(dǎo)Bax表達(dá)的抑制作用以及Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對照組比較，LY組能夠促進(jìn)Bax表達(dá)以及抑制Bcl-2表達(dá)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Shh組和Shh+LY組比較，LY組能夠明顯促進(jìn)Bax表達(dá)以及抑制Bcl-2表達(dá)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2和表6。

圖2 四組Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平

表6 LY294002對Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響(images/BZ_37_1351_1170_1373_1213.png±s)組別對照組Shh組Shh+LY組LY組F值P值Bcl-2 1.00±0.053 1.37±0.060a 1.18±0.068c 0.76±0.042b 48.546 0.001 Bax 1.00±0.058 0.78±0.045a 0.98±0.031c 1.22±0.025b 122.125 0.001images/BZ_10_207_1614_1049_1647.png

3 討論

手術(shù)、放療、化療等方法仍然是早期宮頸癌的治療的主要方法，即使同時(shí)進(jìn)行化療和近距離放療，Ⅲ期和Ⅳ期患者的預(yù)后仍然較差，5年無進(jìn)展生存期和總生存期分別為51%和55%。此外，在診斷時(shí)伴有腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的女性預(yù)后明顯較差。對于持續(xù)性、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性宮頸癌，貝伐單抗聯(lián)合細(xì)胞毒性化療可將總生存期從13.3個(gè)月提高到17.0個(gè)月[11]。盡管有這些進(jìn)展，對于許多淋巴結(jié)陽性的局部晚期和轉(zhuǎn)移性宮頸癌婦女的治療仍滿足不了需求。因此，從發(fā)病機(jī)制探討宮頸癌的治療方法就顯得極其重要。

PI3K/AKT通路是參與正常細(xì)胞過程最重要的信號(hào)通路之一，它的異常激活調(diào)節(jié)自噬、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡、化療耐藥性和許多人類癌癥的轉(zhuǎn)移[12]。新的證據(jù)表明，宮頸癌中HMQ-T-F2可以通過PI3K/AKt信號(hào)通路來抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]，不僅如此，Shh信號(hào)通過PI3K/AKt通路來調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)來促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。PI3K/AKT通路作為相關(guān)癌癥治療潛在策略的不同分子靶點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)主要探討其機(jī)制是否通過PI3K/AKt信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。

Purmorphamine作為小分子激活劑，能夠直接結(jié)合Smoothened(Smo)受體，阻斷BODIPY-cyclopamine與Smo結(jié)合，激活Sonic hedgehog(Shh)信號(hào)通路，研究結(jié)果證實(shí)其激活效果。從而可以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Shh激活能夠促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖，這與SAMARZIJA等[15]研究結(jié)果一致，抑制劑LY294002作用于PI3K/AKt通路后能夠逆轉(zhuǎn)Shh的作用，而LY294002作用后能夠抑制Hela細(xì)胞的增殖作用，這與DIAO等[16]研究顯示LY294002能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡受分子水平的調(diào)控，細(xì)胞凋亡主要受Caspases酶家族以及Bcl-2家族蛋白調(diào)控，因此，本研究將對以上兩條凋亡途徑進(jìn)行檢測，分析PI3K/AKt通路是否也涉及凋亡途徑。Caspases在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵途徑的酶家族，在細(xì)胞凋亡中起到介導(dǎo)者和執(zhí)行者的作用，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，本研究對Caspases酶家族中的Caspase-3和Caspase-9進(jìn)行檢測，Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)能夠反映Hela細(xì)胞凋亡的情況。研究顯示Shh的激活能夠抑制Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，抑制了Caspase-3/Caspase-9凋亡途徑，而LY294002作用后能夠逆轉(zhuǎn)Shh誘導(dǎo)的Caspase-3和Caspase-9抑制作用，說明PI3K/AKt信號(hào)通路參與宮頸癌細(xì)胞Caspase-3/Caspase-9凋亡途徑過程，而且Shh抑制Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)也與PI3K/AKt通路有關(guān)。Bcl-2家族蛋白作為凋亡調(diào)控的另一條重要途徑，Bcl-2蛋白能夠阻止線粒體的細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì),抑制Caspase蛋白酶，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；Bax蛋白可以使細(xì)胞色素C穿過線粒體膜，解除蛋白酶Caspase的抑制作用，使其激活，從而使細(xì)胞凋亡。Bcl-2/Bax細(xì)胞凋亡在宮頸癌的凋亡中也發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。本研究通過激活Shh通路后，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，而抑制PI3K/AKt信號(hào)通路能夠緩解Shh信號(hào)誘導(dǎo)Bax表達(dá)的抑制作用以及Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用，單獨(dú)抑制PI3K/AKt信號(hào)通路能夠促進(jìn)Bax表達(dá)以及抑制Bcl-2表達(dá)，說明PI3K/AKt信號(hào)通路參與宮頸癌細(xì)胞Bcl-2/Bax凋亡途徑過程，而且也參與了Shh信號(hào)誘導(dǎo)Bax表達(dá)的抑制作用以及Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)激活Shh能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡，并且具體機(jī)制可能與PI3K/AKt信號(hào)通路有關(guān)；抑制PI3K/AKt通路能夠抑制宮頸癌的增殖、激活Caspase-3/Caspase-9凋亡途徑以及Bcl-2/Bax凋亡途徑。本研究存在一定的局限性，只局限于宮頸癌Hela細(xì)胞，并且凋亡途徑研究極其有限，需要進(jìn)一步深入研究相關(guān)途徑和機(jī)制。