閆俊輝， 吳沁雪， 王祥旭， 李維琳，2

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢），武漢 430070）

磷脂類物質(zhì)是兩性分子，通常被用作乳化劑. 普通磷脂的分子結(jié)構(gòu)中含有兩個疏水的脂肪酸酯基團(tuán)（疏水尾部）和一個親水的取代基基團(tuán)（親水頭部）. 酶解磷脂是普通磷脂在磷脂酶的作用下水解后的產(chǎn)物，與普通磷脂相比，其少了一個疏水的脂肪酸酯基團(tuán)，多了一個親水的羥基. 研究［1-3］顯示，與普通磷脂相比，酶解磷脂的乳化能力、乳化穩(wěn)定性、抗氧化性、潤濕性均有明顯提升. 磷脂和酶解磷脂作為乳化劑，其乳化能力受許多因素的影響，如游離脂肪酸、pH、鹽離子含量和類型、環(huán)境溫度等. 已有資料顯示，磷脂在儲存過程中會自然降解產(chǎn)生游離脂肪酸，采用酶法制備酶解磷脂的過程中也會產(chǎn)生游離脂肪酸，因此磷脂產(chǎn)品中或多或少也會含有游離脂肪酸，但關(guān)于游離脂肪酸對磷脂或酶解磷脂乳化能力的影響報道很少. 目前，大多數(shù)商業(yè)食品都會添加一些礦物質(zhì)，如鈣、鈉、鎂、鉀等多種離子，以滿足特定風(fēng)味和營養(yǎng)的需要，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在0.04%～0.12%之間，其中高鈣食品一直是賣點之一，但濃度較高的鈣離子添加到液態(tài)食品中容易產(chǎn)生沉淀［4］，影響產(chǎn)品品質(zhì)，而添加磷脂或酶解磷脂可以使這類問題得到極大改善［5］，但是鈣離子和鈉離子的添加是否會對磷脂和酶解磷脂的乳化能力產(chǎn)生影響還未可知.

乳狀液（簡稱乳液）是一種液體以小液滴形式分散在與之不相混溶的另一種液體中形成的分散體系. 乳液可分水包油（O/W）和油包水（W/O）兩種類型. 許多食品、藥品和化妝品制劑都屬于水包油（O/W）型乳液，且都可以通過添加磷脂類物質(zhì)來增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性. 乳液本身是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，溫度、鹽分、pH等因素都可能會對乳液微滴的穩(wěn)定性產(chǎn)生不同程度的影響. 因此，為了得到更加穩(wěn)定的乳液，不僅要掌握乳化劑的性能和使用方法，還要了解各種可能會對乳化劑乳化能力和乳液穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的因素.

根據(jù)磷脂和酶解磷脂制備過程中可能殘留在產(chǎn)品中的物質(zhì)、使用時常會用到的非磷脂類物質(zhì)以及環(huán)境因素，本研究選取了游離脂肪酸、無機(jī)鹽、pH和溫度這幾個因素來分析其對磷脂和不同酶解程度的酶解磷脂乳化能力的影響. 本研究可為磷脂及酶解磷脂的應(yīng)用提供參考.

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

普通磷脂（大豆磷脂），由鄭州四維磷脂技術(shù)有限公司生產(chǎn). C15磷脂（轉(zhuǎn)化率為15%的大豆酶解磷脂）和C60磷脂（轉(zhuǎn)化率為60%的大豆酶解磷脂）均由本實驗室自制［6］（轉(zhuǎn)化率越高表明酶解磷脂的酶解程度越高）. 棕櫚酸、油酸、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸二氫鈉（AR）、氯化鈣（AR）、氯化鈉（AR）、硼砂（AR）、氫氧化鈉（AR）、檸檬酸（AR）均由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

pH儀（梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）、真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、實驗室超純水系統(tǒng)（四川金瀾科技有限公司）、可見光分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）.

1.3 磷脂和酶解磷脂乳液的制備

實驗前將所有玻璃器皿浸入體積分?jǐn)?shù)為10%的硝酸溶液中4 h，然后在使用前用去離子水沖洗，以確保玻璃器皿不受污染.

用0.02 mmol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH=7）分別與一定質(zhì)量的普通磷脂、C15 磷脂、C60 磷脂混合，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的磷脂或酶解磷脂溶液. 磷脂或酶解磷脂溶液與大豆色拉油按照10∶3的體積比混合，用機(jī)械均質(zhì)器在10 000 r/min條件下均質(zhì)3 min，以形成磷脂或酶解磷脂乳液.

1.4 乳化劑乳化能力的測定方法

1.4.1 乳化層法 將配制好的磷脂或酶解磷脂乳液轉(zhuǎn)移到100 mL具塞量筒中，4 h后觀察分層情況并記錄［7-8］.以未析出油脂的比例（即乳化百分比）表示乳化劑的乳化能力，未析出油脂的比例（即乳化百分比）越大，表示乳化劑的乳化能力越強(qiáng).

1.4.2 比色法 對文獻(xiàn)［9-11］中的乳化劑乳化能力測定方法進(jìn)行改進(jìn)，具體如下：首先取200 μL配制好的磷脂或酶解磷脂乳液加入到100 mL容量瓶中，然后加入0.02 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH=7）定容至100 mL，即可得到稀釋500倍的磷脂或酶解磷脂乳液；然后通過可見光分光光度計在波長500 nm下測定乳液稀釋液的OD值（OD500），以O(shè)D500的值表示乳化劑的乳化能力，OD500的值越大，表示乳化劑的乳化能力越強(qiáng).

1.5 不同影響因素對磷脂和酶解磷脂乳化能力測定

1.5.1 游離脂肪酸 根據(jù)大豆磷脂中脂肪酸的種類，選取油酸（OA，單不飽和雙鍵長鏈脂肪酸，C18∶1）和棕櫚酸（PA，飽和脂肪酸，C16∶0）為代表性游離脂肪酸［12-13］，以測定游離脂肪酸對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響. 首先根據(jù)本文1.3小節(jié)中的方法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的磷脂和酶解磷脂溶液，然后在磷脂或酶解磷脂溶液中添加不同比例的油酸或棕櫚酸，使磷脂或酶解磷脂溶液中油酸或棕櫚酸的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.

1.5.2 無機(jī)鹽 選取CaCl2和NaCl作為代表性無機(jī)鹽，通過在磷脂和酶解磷脂乳液中添加不同比例的CaCl2和NaCl來分析無機(jī)鹽對磷脂和酶解磷脂的乳化能力是否有影響. 稱取不同質(zhì)量的CaCl2添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%磷脂和酶解磷脂溶液中，使磷脂或酶解磷脂溶液中CaCl2的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%. 稱取不同質(zhì)量的NaCl添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%磷脂和酶解磷脂溶液中，使磷脂或酶解磷脂溶液中NaCl的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.

1.5.3 pH 用物質(zhì)的量濃度為0.02 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH值分別為3、4、5、6、7、7.5、8、8.5、9、10、11）分別與一定質(zhì)量的普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂混合，配制成pH值不同的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的磷脂或酶解磷脂溶液.

1.5.4 溫度 首先根據(jù)本文1.3小節(jié)中的方法制備磷脂乳液和酶解磷脂乳液，然后將其分別置于量筒中，并于不同溫度下（4、25、50、75 ℃）保溫4 h，最后根據(jù)乳化層法測定磷脂或酶解磷脂的乳化能力.

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 游離脂肪酸對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響

游離脂肪酸對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響見圖1.

圖1 游離脂肪酸對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響Fig.1 Effects of free fatty acids on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

由圖1可知，在磷脂或酶解磷脂乳液中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的油酸或棕櫚酸后均能不同程度地提高磷脂和酶解磷脂的乳化能力；在普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂乳液中分別添加0.4%的油酸后，普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂的乳化能力分別提升了75%、49%、38%；在普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液中分別添加0.4%的棕櫚酸后，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂的乳化能力分別提升了79%、53%、48%. 由此可知，棕櫚酸對磷脂和酶解磷脂乳化能力的提升效果略好于油酸；不論添加的游離脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是多少，酶解磷脂的乳化能力均優(yōu)于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越強(qiáng).

以上結(jié)果表明，磷脂產(chǎn)品含有的少量游離脂肪酸對磷脂的乳化能力沒有不利的影響. 有研究［14］指出，油酸賦予乳液性能的改善是由于乳液的Zeta電位增加和油酸分子之間的相互作用. 也有研究［15］證明，油酸分子可以被磷脂囊泡吸收，改變磷脂形態(tài)，從而使磷脂的乳化能力得以提升. 另有研究［16］表明，在魚油和水形成的O/W型乳液中添加棕櫚酸可以降低O/W型乳液中液滴的表面張力和粒徑，因此在乳液中加入棕櫚酸可以提高乳液的穩(wěn)定性.

2.2 無機(jī)鹽對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響

2.2.1 CaCl2對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響 由圖2可知，在磷脂和酶解磷脂乳液中添加少量的CaCl2就會對磷脂和酶解磷脂的乳化能力產(chǎn)生較大的影響，當(dāng)乳液中CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%時，磷脂和酶解磷脂乳液的破乳效果就已經(jīng)非常明顯. 磷脂和酶解磷脂乳液中CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力就越差. 但不論添加的CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為多少，酶解磷脂的乳化能力都明顯優(yōu)于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

圖2 CaCl2對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響Fig.2 Effects of CaCl2 on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

2.2.2 NaCl對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響 由圖3可知，在普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液中分別添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl 后，普通磷脂、C15 磷脂、C60磷脂的乳化能力均有所降低，但降低幅度很小，說明NaCl對普通磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響均較小. 但不論添加的NaCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為多少，酶解磷脂的乳化能力都明顯優(yōu)于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

圖3 NaCl對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響Fig.3 Effects of NaCl on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

2.3 pH對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響

由圖4 可知，pH 對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響較大，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂的乳化能力均隨著乳液pH值的增大而增強(qiáng)，特別是當(dāng)乳液pH在7～9之間時，磷脂和酶解磷脂的乳化能力提升迅速.另在實驗中可觀察到，pH對普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液的穩(wěn)定性也有較大影響，即pH 越低，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液越不穩(wěn)定，越容易出現(xiàn)相分離，隨pH值的增大，普通磷脂、C15磷脂、C60磷脂乳液的穩(wěn)定性也逐漸增加. 有研究［17］認(rèn)為，pH對磷脂的化學(xué)相互作用以及界面性質(zhì)都有影響，在較低的pH下，磷脂的表面活性較低，形成的界面膜對聚結(jié)的抵抗力也較低，于是乳液液滴趨于聚集，導(dǎo)致乳液的穩(wěn)定性降低. 也有研究［18］認(rèn)為，磷脂乳液在較低pH下不穩(wěn)定可能與磷脂的溶脹性有關(guān)，磷脂在較低pH下會成為更易水解的化合物，從而降低了其作為乳化劑的作用，最終導(dǎo)致其乳化能力降低.

圖4 pH對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響Fig.4 Effects of pH on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

比較發(fā)現(xiàn)，不論在酸性條件下還是在堿性條件下，酶解磷脂的乳化能力均比普通磷脂的乳化能力好，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

2.4 溫度對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響

由圖5 可知，隨著溫度的升高，三種磷脂的乳化百分比均不斷降低，且普通磷脂的乳化百分比下降的最多，C15磷脂次之，C60磷脂的乳化百分比下降的最少，這表明溫度對磷脂和酶解磷脂的乳化能力影響較大，隨著溫度的升高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力均不斷降低. 不論何種溫度條件下，酶解磷脂的乳化能力均優(yōu)于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好. 有研究［19-20］表明，隨著溫度的升高，非離子乳化劑的親水頭部基團(tuán)周圍會脫水，從而導(dǎo)致其親水能力以及其在水中的溶解度降低，于是其乳化能力會有所之降低.

圖5 溫度對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響Fig.5 Effects of temperatures on emulsifying capacity of phospholipids and enzymolyzed phospholipids

3 結(jié)論

通過實驗分析了游離脂肪酸、無機(jī)鹽、pH和溫度對磷脂及不同酶解程度的酶解磷脂乳化能力的影響，得出結(jié)論如下：

1）磷脂產(chǎn)品中含有的少量游離脂肪酸（磷脂的自然降解產(chǎn)生或制備酶解磷脂時產(chǎn)生，如油酸和棕櫚酸）對于磷脂的乳化能力沒有不利影響. 相反，外源性游離脂肪酸的添加可以改善磷脂和酶解磷脂的乳化能力.

2）不同的無機(jī)鹽對磷脂和酶解磷脂乳化能力的影響差別較大. CaCl2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，磷脂和酶解磷脂的乳化能力越差，但在有CaCl2存在的情況下，酶解磷脂的乳化能力明顯優(yōu)于普通磷脂，且酶解磷脂的乳化能力與酶解程度呈正相關(guān)，因此在高鈣液態(tài)食品中加入酶解程度高的酶解磷脂更有利于產(chǎn)品的穩(wěn)定. NaCl對磷脂和酶解磷脂的乳化能力的影響較小，因此磷脂類物質(zhì)適合作為各類咸味食品的乳化劑.

3）在堿性條件下，磷脂和酶解磷脂的乳化能力更好，相應(yīng)的磷脂和酶解磷脂乳液也更穩(wěn)定，但是在酸性條件下磷脂和酶解磷脂的乳化能力則大大降低，且酸性越強(qiáng)，其乳化能力越差，乳液的穩(wěn)定性也越差；無論在堿性、中性或酸性條件下，酶解磷脂的乳化能力都明顯優(yōu)于普通磷脂，且酶解程度越高的酶解磷脂的乳化能力越好.

4）高溫會使磷脂和酶解磷脂的乳化能力降低，且不利于磷脂和酶解磷脂乳液的穩(wěn)定，但在高溫條件下，酶解磷脂的乳化能力明顯優(yōu)于普通磷脂，且酶解磷脂乳液的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于普通磷脂乳液.