何子華，楊成行，王 沛，包愛科，馬 清

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

低溫脅迫是世界范圍內(nèi)造成作物減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要非生物因子之一[1]。我國西北地區(qū)由于特有的大陸性季風(fēng)氣候，干旱少雨且冬夏極端氣溫差異較大，因此水分和溫度成為影響該地區(qū)植物生長的主要環(huán)境因子[2-3]。對于我國西北高寒草甸草原而言，由于高海拔導(dǎo)致冬季寒冷，植物的安全越冬受到嚴(yán)重阻礙，并且春秋季節(jié)氣溫不穩(wěn)定致使植物生長不良，進(jìn)而導(dǎo)致植被嚴(yán)重退化[2]?？梢?，低溫是限制高寒草原地區(qū)多數(shù)植物正常生長最主要的環(huán)境因素[2-3]。因此，篩選具有較強(qiáng)耐寒性的植物是對高寒草地進(jìn)行生態(tài)修復(fù)的關(guān)鍵。

植物耐寒性是長期生活在寒冷條件下的植物適應(yīng)或抵御低溫脅迫的能力，耐寒性強(qiáng)的植物在低溫脅迫下具有特殊或高效的抵御低溫脅迫的生理適應(yīng)機(jī)制，從而維持其正常生長發(fā)育和生理代謝功能[4]。植物耐寒性受多種因素影響，近年來眾多研究常采用葉綠素含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehydem,MDA)含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量等生理生化指標(biāo)評價植物耐寒性。在低溫脅迫條件下，由于低溫導(dǎo)致的酶活性降低、葉綠體及多種細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞，使得植物葉綠素含量降低，光合作用受阻[5-7]；低溫脅迫還會引起植物體內(nèi)活性氧自由基的大量積累，誘導(dǎo)膜脂過氧化并產(chǎn)生MDA，因此MDA的含量可反映植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度[8-11]；SOD 是植物活性氧清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一，可協(xié)同清除植物在逆境條件下產(chǎn)生的大量活性氧自由基，保護(hù)植物免受傷害[12-14]；可溶性糖和脯氨酸是細(xì)胞內(nèi)兩種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[15-16]，能通過增加細(xì)胞保水能力和穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的代謝過程來提高植物的耐寒性[16-18]，大量研究表明，可溶性糖和脯氨酸的含量與植物的耐寒性具有顯著的正相關(guān)關(guān)系[12,19-23]。然而，由于植物耐寒指標(biāo)和生理適應(yīng)機(jī)制的多樣性，分析單一指標(biāo)往往不能真實(shí)反映植物的耐寒性強(qiáng)弱，因此利用隸屬函數(shù)法綜合分析其耐寒性相關(guān)指標(biāo)，能較為全面地評價和比較植物耐寒性[9,12-13]。

禾本科牧草是高寒地區(qū)經(jīng)濟(jì)價值最大、種類最多、分布最廣的天然草地植物資源[24]。由于甘南等西北高寒地區(qū)年平均氣溫約為4 ℃，其中夏季平均氣溫僅8～14 ℃[25]，使得高寒地區(qū)禾本科牧草的生長常年面臨著低溫脅迫。因此，研究和評價重要禾本科牧草耐寒性并進(jìn)一步篩選出優(yōu)質(zhì)的抗寒種質(zhì)資源，對高寒地區(qū)生態(tài)環(huán)境修復(fù)、畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及抗寒品種選育均具有重要的理論和實(shí)踐意義。景美玲[26]對青藏高原等高寒地區(qū)引進(jìn)或育成的16 種多年生禾本科牧草品種的形態(tài)學(xué)特征、生產(chǎn)性能和越冬率等進(jìn)行了比較研究，確定了青牧一號老芒麥(Elymus sibiricus‘Qingmu No.1’)、青海冷地早熟禾(Poa crymophila‘Qinghai’)、青海扁莖早熟禾(P. pratensisvar. anceps Gaud ‘Qinghai’)、青海中華羊茅(Festuca sinensis‘Qinghai’)、同德短芒披堿草(E. breviaristatus‘Tongde’) 和 同 德 老 芒 麥(E.sibiricus‘Tongde’)等適宜在高寒地區(qū)推廣種植的牧草品種，但關(guān)于上述牧草品種對低溫脅迫的生理響應(yīng)和耐寒性綜合評價的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究以高寒地區(qū)草地恢復(fù)建植中主推的6 種禾本科牧草[26]為材料進(jìn)行低溫脅迫處理，分析和比較了其生物量、葉綠素含量、MDA 含量、SOD 活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量的變化，并利用隸屬函數(shù)法綜合評價了6 種禾本科牧草耐寒性，以期篩選出耐寒性強(qiáng)的禾本科牧草品種，為高寒地區(qū)天然草地的恢復(fù)建植奠定重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用的6 種牧草品種青海扁莖早熟禾、青海冷地早熟禾、同德老芒麥、青牧一號老芒麥、青海中華羊茅和同德短芒披堿草均為國家牧草審定委員會登記并適合青藏高原等高寒地區(qū)推廣種植的多年生禾本科牧草[26]，種子由青海大學(xué)劉文輝研究員贈送。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽法，按照15 g·m?2的密度均勻撒播于以蛭石為基質(zhì)的塑料營養(yǎng)缽(17 cm × 15 cm)中。盆栽苗放于晝夜溫度為28 ℃/23 ℃、光照時長為16 h·d?1、 光 強(qiáng) 約 為800 μmol·(m2·s)?1、 相 對 濕 度為65%的人工氣候箱中，使用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液(1 mmol·L?1KNO3，0.25 mmol·L?1Ca(NO3)2·4 H2O，0.25 mmol·L?1MgSO4·7 H2O，0.25 mmol·L?1KH2PO4，0.03 mmol·L?1Fe-citrate·3 H2O，50 μmol·L?1H3BO3，10 μmol·L?1MnCl2·4 H2O，0.05 μmol·L?1Na2MoO4·2 H2O，1.6 μmol·L?1ZnSO4·7 H2O，0.6 μmol·L?1CuSO4，pH 5.8)進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d 添加適量營養(yǎng)液以使基質(zhì)含水量始終維持在70%田間最大持水量。

培養(yǎng)1 個月后，選取生長良好的各品種植株分為2 組，分別置于25 ℃(對照組)和0 ℃(低溫脅迫處理組) 的人工氣候箱進(jìn)行處理。處理期間每3 d 添加適量營養(yǎng)液使基質(zhì)含水量維持在70%田間最大持水量。3 周后，取樣測定相關(guān)生理生化指標(biāo)。所有處理設(shè)6 個重復(fù)。

1.3 指標(biāo)測定及方法

剪取各處理組材料葉片，蒸餾水沖洗3 次后，用濾紙將表面水分迅速吸干并稱取鮮重，隨后置于105 ℃的烘箱中殺青10 min，再于80 ℃下烘干48 h，放入干燥器中冷卻至室溫，取出材料稱取干重。采用乙醇熱浸法測定葉綠素含量[27-28]，氮藍(lán)四挫法測定葉中SOD 酶活性[29]，硫代巴比妥酸法測定葉中MDA 含量[29]，酸性茚三酮法測定葉中脯氨酸含量[27-28]，蒽酮比色法測定葉中可溶性糖含量[27-28]。依照如下公式計(jì)算低溫脅迫下各指標(biāo)的變化幅度[30-31]：

1.4 耐寒性綜合評價方法

采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)法評價試驗(yàn)材料耐寒性，并通過如下公式對各類指標(biāo)的隸屬函數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，然后對6 種禾草的耐寒性進(jìn)行綜合評價。為消除不同禾本科牧草種間遺傳背景的差異，采用各指標(biāo)的變化幅度計(jì)算隸屬函數(shù)值[30-31]。如果指標(biāo)與耐寒性正相關(guān)，隸屬函數(shù)值的計(jì)算采用公式(1)，如果指標(biāo)與耐寒性負(fù)相關(guān)，則采用公式(2)[32-35]。利用上述公式得出6 種禾本科牧草各指標(biāo)隸屬值的平均值，并進(jìn)行比較，平均值越大則植物的耐寒性越強(qiáng)。

式中：Zij表示i品種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xij表示i品 種j指 標(biāo) 的 測 定 值，Xjmax和Xjmin表 示 各 品種j指標(biāo)的最大值和最小值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 制圖，SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下6 種禾本科牧草的長勢變化

低溫脅迫處理3 周后，6 種禾本科牧草的長勢均明顯弱于對照組(圖1)，表明低溫脅迫對6 種禾本科牧草的生長均產(chǎn)生不同程度的抑制。

圖1 低溫脅迫下6 種禾本科牧草長勢對比Figure 1 Growth status of six species of grasses under low-temperature stress

2.2 低溫脅迫下6 種禾本科牧草各指標(biāo)變化

低溫脅迫下，6 種禾本科牧草的鮮重和干重與各自對照相比均顯著下降(P< 0.05)；相比而言，青海扁莖早熟禾、青海冷地早熟禾和青牧一號老芒麥的鮮重和干重降幅較低，其中，青海冷地早熟禾鮮重降幅最小，而青牧一號老芒麥的干重降幅最小(圖2)。

圖2 低溫脅迫下6 種禾本科牧草的鮮重和干重變化Figure 2 Changes in the fresh weight and dry weights in six species of grasses under low-temperature stress

與對照處理相比，低溫脅迫下6 種禾本科牧草的葉綠素含量均顯著下降(P< 0.05)；其中，青海中華羊茅和同德老芒麥葉綠素含量降幅較低，分別下降了34.1% 和36.1%，而青海扁莖早熟禾和同德短芒披堿草的葉綠素含量降幅較大，分別降低了64.3%和58.2% (圖3)。表明，相較于其他禾本科牧草，低溫脅迫對青海中華羊茅和同德老芒麥葉綠素合成的影響相對較小。

圖3 低溫脅迫下6 種禾本科牧草的葉綠素含量、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性變化Figure 3 Changes in chlorophyll content, MDA content, soluble sugar content, proline content and SOD activity in six species of grasses under low temperature stress

低溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量活性氧自由基，誘導(dǎo)膜脂過氧化，產(chǎn)生大量MDA[8-9,19]。與對照相比，低溫脅迫下6 種禾本科牧草葉中MDA 含量均呈增加趨勢，其中青牧一號老芒麥和青海冷地早熟禾與對照相比差異不顯著(P> 0.05)，且青牧一號老芒麥MDA 含量增幅最小，僅為8.6%；而青海扁莖早熟禾、同德老芒麥、青海中華羊茅和同德短芒披堿草葉中MDA 含量比各自對照分別顯著增加了18.4%、76.2%、43.2%和37.2% (P< 0.05)。由此可知，低溫脅迫下青牧一號老芒麥葉組織細(xì)胞膜脂受到的傷害最小。

低溫脅迫下，青牧一號老芒麥、青海中華羊茅和青海冷地早熟禾葉中可溶性糖含量較對照處理顯著增加(P< 0.05)，增幅分別為84.0%、65.0%和43.4%，其余3 種禾本科牧草葉中可溶性糖含量與對照相比雖有10%左右的增幅，但差異并不顯著(P>0.05)。這表明，青牧一號老芒麥、青海中華羊茅和青海冷地早熟禾在低溫脅迫下可通過積累可溶性糖以進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，緩解低溫脅迫造成的傷害。

相較于對照處理，低溫脅迫下6 種禾本科牧草葉中脯氨酸含量均顯著增加(P< 0.05)，其中青牧一號老芒麥、同德老芒麥和青海中華羊茅在低溫脅迫下脯氨酸含量較高，且增幅也較大，分別顯著增加了535.2%、433.0%和387.1% (P< 0.05)。這表明，上述3 種禾本科牧草可在低溫脅迫下大量積累脯氨酸，以維持細(xì)胞內(nèi)較低的滲透勢。

SOD 作為植物活性氧清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一，其活性是反映植物抗寒能力的一個重要指標(biāo)[12-13]。相較于對照處理，低溫脅迫下青牧一號老芒麥葉中SOD 活性顯著增加了37.6% (P< 0.05)；其余5 種禾本科牧草葉中SOD 活性較對照無顯著變化(P>0.05)。這表明，增加葉中SOD 酶活性以清除大量活性氧可能是青牧一號老芒麥抵御低溫脅迫的一種重要機(jī)制。

2.3 6 種禾本科牧草耐寒性綜合評價

計(jì)算上述生理生化指標(biāo)的變化幅度在不同牧草品種中的隸屬函數(shù)值，并以各指標(biāo)的平均隸屬值作為確定6 種禾本科牧草耐寒性強(qiáng)弱的綜合評價指標(biāo)(表1)。根據(jù)隸屬函數(shù)值越大、耐寒性越強(qiáng)的評價原則可以看出，青牧一號老芒麥隸屬值為0.915，在6 種禾本科牧草中最高，其耐寒性最強(qiáng)；同德老芒麥隸屬值為0.321，其隸屬值最低，耐寒性最弱。6 種禾本科牧草耐寒性強(qiáng)弱順序依次為青牧一號老芒麥 > 青海中華羊茅 > 青海冷地早熟禾 > 青海扁莖早熟禾 > 同德短芒披堿草 > 同德老芒麥。

表1 6 種禾本科牧草抗寒性各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及評價值Table 1 Subordinate function value and evaluation value of each index of cold resistance of six species of grasses

3 討論

3.1 葉綠素與6 種禾本科牧草耐寒性的關(guān)系

在低溫脅迫下，葉綠體的超微結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠素合成酶的活性顯著降低，導(dǎo)致葉綠素含量下降[5-7,36]。嚴(yán)青等[7]在3 種牧草幼苗耐寒生理指標(biāo)的研究中發(fā)現(xiàn)，0 ℃低溫處理下，隨著處理時間的延長，3 種牧草葉綠素含量逐漸減少，且耐寒性最弱的垂穗披堿草的葉綠素含量下降幅度最大。因而，葉綠素含量的變化可作為評判植物耐寒性的重要指標(biāo)。葉綠素含量在低溫脅迫下的變化越小，表明植物在低溫條件下葉綠體結(jié)構(gòu)受到的傷害越小，植物的耐寒性越強(qiáng)[5-7]。本研究中，與對照處理相比，低溫脅迫下6 種禾本科牧草的葉綠素含量均顯著降低(P< 0.05)，其中，青海冷地早熟禾、同德老芒麥、青牧一號老芒麥、青海中華羊茅的葉綠素含量降幅遠(yuǎn)小于青海扁莖早熟禾和同德短芒披堿草的葉綠素含量降幅(圖3)。因此，依據(jù)葉綠體損傷程度判斷，低溫脅迫下青海冷地早熟禾、同德老芒麥、青牧一號老芒麥、青海中華羊茅的耐寒性較強(qiáng)。

3.2 丙二醛(MDA)和過氧化物歧化酶(SOD)與6 種禾本科牧草耐寒性的關(guān)系

正常生理?xiàng)l件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生反應(yīng)與清除系統(tǒng)保持一定的平衡，以保護(hù)植物體免受活性氧的傷害；而在低溫脅迫下，植物氧代謝受到干擾，產(chǎn)生大量活性氧自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化作用，產(chǎn)生大量MDA[8-9]。同時，為保護(hù)細(xì)胞膜免受活性氧傷害，SOD 等細(xì)胞膜保護(hù)酶的活性也相應(yīng)升高[22,37-38]。有研究表明，植物遭受的低溫脅迫程度越高，細(xì)胞膜脂過氧化作用越強(qiáng)，其體內(nèi)MDA含量也越高，因此MDA 的含量與膜損傷程度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[19]。張尚雄等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同德老芒麥在低溫脅迫下MDA 含量急劇增加，增加幅度遠(yuǎn)大于其他材料，說明同德老芒麥的抗寒能力相對較弱，這與本研究結(jié)果相符(圖3)；李卓夫等[39]發(fā)現(xiàn)，隨低溫脅迫處理溫度的下降，小麥(Triticum aestivum)體內(nèi)SOD 活性均快速上升；翟飛飛等[20]研究發(fā)現(xiàn)，耐寒性強(qiáng)的多年生黑麥草(Lolium perenne) SOD 活性變化率較大?？梢?，植物耐寒性與其SOD 活性水平有重要關(guān)系。耐寒性強(qiáng)的植物在低溫脅迫下可維持較高的SOD 活性，以清除植物產(chǎn)生的大量活性氧自由基，維持植物體內(nèi)氧代謝機(jī)制的平衡，增強(qiáng)膜脂抗氧化能力，導(dǎo)致MDA 含量下降[21,39]。本研究中，青牧一號老芒麥在低溫脅迫下的MDA 含量較對照無顯著性增加(P> 0.05)，增幅也最低，同時SOD 活性在低溫脅迫下顯著增強(qiáng)(P<0.05)，且增幅高于其他5 種禾本科牧草(圖3)。據(jù)此可推斷，青牧一號老芒麥可能具有更強(qiáng)的耐寒性。

3.3 可溶性糖和脯氨酸與6 種禾本科牧草耐寒性的關(guān)系

可溶性糖和脯氨酸作為多數(shù)植物體內(nèi)兩種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量高低常被用作判斷植物耐寒性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[21]。植物在低溫脅迫下，可溶性糖和脯氨酸大量積累，使細(xì)胞液的濃度急劇增高[21-22]，細(xì)胞滲透壓的增高使細(xì)胞不易脫水，冰點(diǎn)下降，降低了低溫脅迫對植物的傷害[18]。研究表明，可溶性糖和脯氨酸能降低細(xì)胞滲透勢，并有穩(wěn)定和保護(hù)生物大分子的功能，其含量的高低與植物的耐寒性呈正相關(guān)關(guān)系[23-24]。田彥鋒等[21]在草地早熟禾耐寒性的研究中發(fā)現(xiàn)，植株可溶性糖和脯氨酸含量均隨低溫脅迫時間的延長逐漸增加；同樣，張尚雄等[19]的研究中，在低溫脅迫下兩種耐寒性較強(qiáng)的披堿草屬牧草可溶性糖和脯氨酸含量均顯著增加(P<0.05)?？梢姡诘蜏孛{迫下，植物體內(nèi)可溶性糖和脯氨酸的含量增加越多，其耐寒性越強(qiáng)[40-41]。本研究中，低溫脅迫下，6 種禾本科牧草可溶性糖含量增幅由高到低依次是青牧一號老芒麥、青海中華羊茅、青海冷地早熟禾、青海扁莖早熟禾、同德老芒麥和同德短芒披堿草，而脯氨酸含量增幅由高到低依次是青牧一號老芒麥、同德老芒麥、青海中華羊茅、青海扁莖早熟禾、同德短芒披堿草和青海冷地早熟禾(圖3)。由此可知，在低溫處理下青牧一號老芒麥和青海中華羊茅的兩種主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增幅都較高，這表明，這兩種禾本科牧草可能具有更高效的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，以增強(qiáng)其耐寒性。

3.4 6 種禾本科牧草耐寒性的綜合評價

由于不同植物間耐寒機(jī)制存在差異、且耐寒性受多種指標(biāo)綜合影響，采用單個指標(biāo)評價植物耐寒性具有片面性[12]。因此，常采用隸屬函數(shù)法等綜合指標(biāo)評價方法比較植物耐寒性[42-43]，近年來相關(guān)研究中多使用隸屬函數(shù)法評價禾本科牧草耐寒性[12,19,44-45]，如賈祥等[12]采用隸屬函數(shù)法評價了4 種禾本科牧草耐寒性，結(jié)果表明垂穗披堿草(Elymus nutans)和紫花針茅(Stipa purpurea)耐寒性最強(qiáng)，賴草(Leymus secalinus)耐寒性中等，黑麥草耐寒性最弱。本研究亦采用隸屬函數(shù)法計(jì)算了6 種禾本科牧草在低溫脅迫下鮮重、干重、葉綠素含量、SOD 活性、MDA 含量、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量7 種指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，并依據(jù)該值對6 種禾本科牧草的耐寒性進(jìn)行綜合評價，使評價結(jié)果更能全面反映6 種禾本科牧草實(shí)際抗寒能力。根據(jù)其耐寒性綜合評價排序結(jié)果，青牧一號老芒麥的耐寒性最強(qiáng)，青海中華羊茅次之，青海冷地早熟禾和青海扁莖早熟禾耐寒性中等，同德短芒披堿草和同德老芒麥耐寒性較弱。

4 結(jié)論

本研究通過比較青牧一號老芒麥、同德老芒麥、同德短芒披堿草、青海冷地早熟禾、青海扁莖早熟禾和青海中華羊茅6 種禾本科牧草在0 ℃低溫脅迫下鮮重、干重、游離脯氨酸含量、可溶性糖含量、葉綠素含量、SOD 活性和MDA 含量等生理指標(biāo)的變化，并通過隸屬函數(shù)值法綜合評價了它們的耐寒性。主要結(jié)論如下：

1) 0 ℃低溫脅迫下，6 種禾本科牧草的生長均受到不同程度的抑制，其中，青海冷地早熟禾鮮重降幅最小，青牧一號老芒麥的干重降幅最小。

2) 與25 ℃對照相比，0 ℃低溫脅迫下6 種禾本科牧草葉綠素含量均呈下降趨勢，而MDA 含量、SOD 活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量均呈增加趨勢。

3) 運(yùn)用隸屬函數(shù)法的綜合評價表明，6 種禾本科牧草耐寒性強(qiáng)弱依次為青牧一號老芒麥 > 青海中華羊茅 > 青海冷地早熟禾 > 青海扁莖早熟禾 >同德短芒披堿草 > 同德老芒麥。