高 悅，方 琳，周 炫，張 弦

(湖北省婦幼保健院 婦科,湖北 武漢430070)

子宮肌瘤是最常見的婦科腫瘤，在育齡期婦女中發(fā)病率約25%-40%，40歲以上婦女中發(fā)病率則高達(dá)50%[1]。目前手術(shù)切除是臨床治療子宮肌瘤的常用方式，但由于子宮肌瘤自身具有生長特性，術(shù)后面臨著一定的肌瘤殘留及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)需二次手術(shù)，增加患者痛苦[2]。因此，亟待探究子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后相關(guān)影響因素，提升預(yù)測準(zhǔn)確性，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率。肌瘤始于單個(gè)子宮平滑肌細(xì)胞的單克隆增殖，盡管目前驅(qū)動(dòng)肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為子宮肌瘤的潛在過程尚未完全了解，但已證實(shí)遺傳、激素及生物學(xué)因素有助于其發(fā)展、生長和維持，這些因素包括類固醇激素、生長因子、細(xì)胞因子、染色體、遺傳和表觀遺傳畸變等[3-4]。雌激素是膽固醇衍生類固醇激素，除對(duì)其他身體系統(tǒng)有多效作用外，在女性生殖生理中也起著至關(guān)重要的作用，其通過靶向雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)、雌激素受體β(estrogen receptor β,ERβ)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和雌激素應(yīng)答基因參與子宮肌瘤病理過程。由硫酸基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases,SULTs)家族催化的硫酸化是類固醇激素的主要失活機(jī)制，與ERα、ERβ共同作用調(diào)節(jié)雌激素代謝。目前已有關(guān)于硫酸基轉(zhuǎn)移酶基因1A3(sulfotransferases 1A3,SULT1A3)、ERα、ERβ在子宮肌瘤組織中表達(dá)情況的研究，但鮮有關(guān)于三者對(duì)子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后預(yù)測價(jià)值的報(bào)道[5]。鑒于此，本研究選取335例子宮肌瘤患者，分析子宮肌瘤組織中SULT1A3、ERα、ERβ表達(dá)情況，并分析其對(duì)子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后預(yù)測價(jià)值。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2018年1月湖北省婦幼保健院子宮肌瘤患者335例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《現(xiàn)代子宮肌瘤診斷與治療》中子宮肌瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)影像學(xué)及術(shù)后標(biāo)本病理學(xué)檢查證實(shí)；(2)符合子宮肌瘤切除術(shù)指征，無手術(shù)禁忌癥；(3)平素月經(jīng)規(guī)律，無內(nèi)科合并癥；(4)入組前未接受相關(guān)治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌性疾病、自身免疫性疾病；(2)肝、腎、心等主要臟器器質(zhì)性病變；(3)合并其他部位腫瘤。本研究獲取醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑、儀器

兔抗人SULT1A3、ERα、ERβ一抗(美國Santa cruz公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；WD750S抗原修復(fù)微波爐(中國格蘭仕集團(tuán))；RM2235病理切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司]；Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)。

1.3 方法

1.3.1組織取材

術(shù)后切取子宮肌瘤組織，取距離肌瘤組織>2 cm的正常子宮肌層組織，以避免環(huán)境差異、個(gè)體內(nèi)分泌激素水平差異等影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。標(biāo)本取材后，一部分固定于4%多聚甲醛中12-24 h用于免疫組化染色，另一部分保存于液氮中用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.3.2免疫組化染色檢測SULT1A3、ERα、ERβ表達(dá)

取固定于4%多聚甲醛中的子宮肌瘤組織與正常子宮肌層組織，連續(xù)冠狀切片(厚度10 μm)，常規(guī)脫蠟至水。置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液及微波爐中溫火8 min至沸騰，停火8 min再次溫火沸騰8 min行抗原修復(fù)，自然冷卻，PBS洗滌5 min×3次；切片置于3%過氧化氫溶液中室溫避光孵育30 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS洗滌5 min×3次；滴加3% BSA，37 ℃封閉30 min；從封閉液中取出切片，稍干后滴加工作濃度為1∶200的兔抗人SULT1A3、ERα、ERβ一抗，4 ℃孵育過夜；切片于PBS中搖床洗滌，5 min×3次，滴加工作濃度為1∶800的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；PBS洗滌切片5 min×3次，滴加DAB顯色液至顯微鏡下可觀察到棕褐色顆粒；蘇木精復(fù)染5 min，自來水沖洗并經(jīng)分化液分化2 s，自來水沖洗，蘇木精返藍(lán)60 s，自來水沖洗；常規(guī)脫水、封片，顯微鏡下觀察。

根據(jù)Sinicrope改良法判斷免疫組化結(jié)果，以細(xì)胞核或細(xì)胞漿中棕黃色顆粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)，SULT1A3主要表達(dá)于胞漿中，在細(xì)胞漿中可觀察到棕褐色顆粒，ERα、ERβ主要表達(dá)于胞核中，在細(xì)胞核中可觀察到棕褐色顆粒。染色細(xì)胞計(jì)數(shù)<5%、5%-25%、25%-50%、50%-75%、>75%分別為0、1、2、3、4分，染色強(qiáng)度不顯色、淺黃色、棕黃色、深棕色分別為0、1、2、3分，染色細(xì)胞計(jì)數(shù)×染色強(qiáng)度<1分、2-3分、4-5分、>5分分別為陰性、弱陽性(+)、中度陽性(++)、強(qiáng)陽性(+++)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不相鄰視野進(jìn)行觀察，取均值。

1.3.3Western blot檢測SULT1A3、ERα、ERβ蛋白表達(dá)

取液氮保存的子宮肌瘤組織與正常子宮肌層組織，充分研磨勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，RIPA細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，離心后BCA試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg待檢測樣本按比例上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性，離心取上清，恒壓下電泳后濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液封閉2 h，加入1∶1 000 兔抗人SULT1A3、ERα、ERβ一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，加入1∶8 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，加入ECL顯影液在暗室中曝光、顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析灰度值，以目的基因與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4預(yù)后判斷

術(shù)后隨訪3年，隨訪內(nèi)容包括超聲及婦科檢查內(nèi)容，隨訪結(jié)果判定[7]：預(yù)后良好即經(jīng)期延長、經(jīng)量增多、白帶增多、尿頻、尿潴留、排尿困難等癥狀明顯改善；無腸粘連、腸梗阻、感染等并發(fā)癥；超聲檢查子宮形態(tài)恢復(fù)正常；無復(fù)發(fā)。將預(yù)后良好患者設(shè)置為良好組，其余設(shè)置為預(yù)后不良組。

1.3.5臨床資料收集與賦值

收集良好組、不良組臨床資料，并進(jìn)行賦值，包括年齡(連續(xù)變量)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)(連續(xù)變量)、吸煙(否=0；是=1)、飲酒(否=0；是=1)、合并基礎(chǔ)性疾病種類(連續(xù)變量)、家族史(無=0；有=1)、初潮年齡(連續(xù)變量)、孕產(chǎn)次(連續(xù)變量)、>1位性伴侶(否=0；是=1)、長期口服避孕藥(是=0；否=1)、絕經(jīng)(是=0；否=1)、盆腔粘連(無、輕度=0；中度=1；重度=2)、肌瘤數(shù)目(單發(fā)=0；多發(fā)=1)；肌瘤位置(漿膜下=0；肌壁間=1)；肌瘤類型(前壁=0；宮底、后壁=1)、肌瘤有粗大血管供應(yīng)(無=0；有=1)、子宮肌瘤直徑(<5 cm=0；≥5 cm=1)、血清雌二醇(連續(xù)變量)、血清孕酮(連續(xù)變量)、血清黃體生成素(連續(xù)變量)、手術(shù)方式(腹腔鏡手術(shù)=0；開腹手術(shù)=1)、術(shù)后輔助藥物治療(有=0；無=1)、SULT1A3(連續(xù)變量)、ERα(連續(xù)變量)、ERβ(連續(xù)變量)。對(duì)上述可能影響子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后的因素進(jìn)行賦值，并以之為自變量，以預(yù)后(良好=0，不良=1)為因變量行Logistic回歸分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮肌瘤組織、正常子宮肌層組織中SULT1A3、ERα、ERβ表達(dá)

子宮肌瘤組織中SULT1A3陽性表達(dá)率低于正常子宮肌層組織，ERα、ERβ陽性表達(dá)率高于正常子宮肌層組織(P<0.05)。見表1、圖1-3。

表1 兩種組織中SULT1A3、ERα、ERβ陽性表達(dá)率比較[n(%)]

2.2 子宮肌瘤組織、正常子宮肌層組織中SULT1A3、ERα、ERβ表達(dá)

子宮肌瘤組織中SULT1A3蛋白相對(duì)表達(dá)量低于正常子宮肌層組織，ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常子宮肌層組織(P<0.05)。見表2、圖4。

圖1 SULT1A3在子宮肌瘤組織、正常子宮肌層組織中免疫組化染色結(jié)果(×400)

圖2 ERα在子宮肌瘤組織、正常子宮肌層組織中免疫組化染色結(jié)果(×400)

圖3 ERβ在子宮肌瘤組織、正常子宮肌層組織中免疫組化染色結(jié)果(×400)

2.3 良好組、不良組子宮肌瘤組織SULT1A3、ERα、ERβ蛋白表達(dá)及其他預(yù)后可能影響因素差異比較

隨訪過程中335例患者中失訪35例，納入的300例患者中預(yù)后良好261例(87.00%)，設(shè)為良好組，預(yù)后不良39例(13.00%)，設(shè)為不良組；不良組BMI，子宮肌瘤組織ERα、ERβ蛋白表達(dá)量，前壁肌瘤、子宮肌瘤直徑≥5 cm，開腹手術(shù)構(gòu)成比高于良好組，子宮肌瘤組織SULT1A3蛋白表達(dá)量低于良好組(P<0.05)；兩組年齡、吸煙、飲酒、合并基礎(chǔ)性疾病種類、家族史、初潮年齡、孕產(chǎn)次、>1位性伴侶、長期口服避孕藥、絕經(jīng)、盆腔粘連、肌瘤數(shù)目、肌瘤位置、肌瘤有粗大血管供應(yīng)、血清雌二醇、血清孕酮、血清黃體生成素、術(shù)后輔助藥物治療臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 兩種組織中SULT1A3、ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 Logistic回歸分析法分析子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后影響因素

Logistic回歸分析法顯示，BMI、前壁肌瘤、SULT1A3、ERα、ERβ均是子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后影響因素(P<0.05)。見表4。

圖4 SULT1A3、ERα、ERβ蛋白表達(dá)Wstern Blot圖

表3 子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后單因素分析

表4 子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后多因素分析

2.5 子宮肌瘤組織SULT1A3、ERα、ERβ水平檢測對(duì)子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后預(yù)測價(jià)值

三者聯(lián)合診斷時(shí)以串聯(lián)方式進(jìn)行；SULT1A3、ERα、ERβ判斷子宮肌瘤切除術(shù)后預(yù)后不良的最佳截?cái)帱c(diǎn)分別為0.15、0.80、0.43，三者單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后不良的AUC分別為0.701、0.742、0.739、0.795。見表5、圖5。

表5 子宮肌瘤組織SULT1A3、ERα、ERβ預(yù)測子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后預(yù)測價(jià)值

圖5 SULT1A3、ERα、ERβ單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后不良的ROC圖

3 討論

目前關(guān)于子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制尚待明確，通常認(rèn)為其是孕激素與雌激素、催乳素、雄激素等相互作用所致的激素依賴性腫瘤，與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常、細(xì)胞增殖與凋亡、基因等多種因素有關(guān)[8-9]。然而，目前采用激素療法、激素受體調(diào)節(jié)劑、生長因子調(diào)節(jié)劑等并不能將其徹底治愈，仍以開腹及腹腔鏡下肌瘤剔除術(shù)等手術(shù)治療為主，因此推測另有其他因素參與該病發(fā)生，且對(duì)預(yù)后具有一定影響。

本研究免疫組化、Western Blot結(jié)果顯示，與正常子宮肌層組織比較，子宮肌瘤組織中SULT1A3表達(dá)降低，ERα、ERβ表達(dá)增加，且通過比較預(yù)后不良及預(yù)后良好患者臨床資料差異并采用Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，除BMI、前壁肌瘤等常規(guī)因素外，子宮肌瘤組織SULT1A3、ERα、ERβ蛋白表達(dá)也是子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后的影響因素，提示SULT1A3、ERα、ERβ均異常表達(dá)于子宮肌瘤組織，且可影響預(yù)后。BMI高時(shí)機(jī)體中脂肪含量較多，對(duì)雄激素轉(zhuǎn)換為雌激素具有明顯的促進(jìn)作用，且由肝臟產(chǎn)生的性激素與蛋白的結(jié)合減少，機(jī)體中雌激素水平增加，刺激子宮肌瘤生長，增加復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[10]。前壁肌瘤臨近組織器官多為正常子宮及膀胱，距離骶骨、腸道較遠(yuǎn)，在行手術(shù)切除時(shí)難度較低，且沖洗盆腔及腹腔時(shí)更為徹底，減少術(shù)后新生粘連，安全性相對(duì)較高，預(yù)后較好。宮底、后壁肌瘤臨近組織器官多為腸道，且深方與骶骨距離較低，手術(shù)難度高，預(yù)后不良。雌激素是誘發(fā)子宮肌瘤的重要內(nèi)分泌因素，并對(duì)機(jī)體多種組織及器官的生理過程均具有調(diào)節(jié)作用，其與ERα、ERβ兩種雌激素靶基因啟動(dòng)子中的增強(qiáng)子元件結(jié)合形成二聚體，從而激活或抑制下游靶基因表達(dá)，引發(fā)對(duì)應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)被認(rèn)為是子宮肌瘤生長的基礎(chǔ)[11]。有研究顯示[12]，相較于雌激素，雌激素受體水平更能確切反映激素生物學(xué)作用，高雌激素受體水平的子宮肌瘤患者在術(shù)后需密切觀察，預(yù)防復(fù)發(fā)或殘留的肌瘤組織迅速增長、惡變。近年來，SULTs因其可影響性激素的生理效應(yīng)成為腫瘤研究熱點(diǎn)，其中SULT1A3具有較強(qiáng)的雌激素親和力，通過催化雌激素與其代謝產(chǎn)物進(jìn)行硫酸化代謝，生成雌激素硫酸酯復(fù)合物-磷酸化雌激素，阻斷雌激素與ERα、ERβ的結(jié)合致其喪失活性[13-14]。子宮肌瘤組織SULT1A3低表達(dá)可刺激內(nèi)源性雌激素分泌，導(dǎo)致其異常堆積，從而促進(jìn)子宮肌瘤生長，增加術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致預(yù)后不良。有研究認(rèn)為[15]，手術(shù)方式、肌瘤大小、部位、患者有無合并癥均與子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后密切相關(guān)，但本研究在將以上單因素納入Logistic回歸時(shí)發(fā)現(xiàn)均為無關(guān)因素，分析原因與本研究納入樣本量較少、患者個(gè)體差異較大有關(guān)。

此外，本研究結(jié)果中，子宮肌瘤組織SULT1A3、ERα、ERβ單獨(dú)及聯(lián)合檢測預(yù)測子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后的AUC分別為0.701、0.742、0.739、0.795，提示三者聯(lián)合檢測的預(yù)測效能高于單獨(dú)檢測。在子宮肌瘤中與雌激素有關(guān)的途徑表現(xiàn)出復(fù)雜性和連通性的基本特征，此外有新證據(jù)表明，較高的ERα與ERβ比率而不是單獨(dú)的ERα或ERβ水平可能是腫瘤強(qiáng)生長能力的特征[16-18]。盡管SULT1A3、ERα、ERβ之間具體的協(xié)同關(guān)系、程度尚待進(jìn)一步研究，因此三者聯(lián)合檢測對(duì)子宮肌瘤術(shù)預(yù)后預(yù)測效能高于單獨(dú)檢測。

綜上所述，子宮肌瘤組織中SULT1A3表達(dá)異常降低，ERα、ERβ表達(dá)異常升高，三者聯(lián)合檢測對(duì)子宮肌瘤切除術(shù)預(yù)后預(yù)測效能高。