劉江帆，魏丹丹，李朝紅

(河南省直第三人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州450000)

肺癌是最常見的癌癥之一[1-2]。微小RNA(MicroRNA，miRNA/miR)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，參與細(xì)胞周期、增殖、凋亡等不同的細(xì)胞生理過程[3]。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在癌細(xì)胞中異常表達(dá)，被認(rèn)為是治療癌癥的潛在靶點(diǎn)/藥物，包括肺癌[4]。有學(xué)者對(duì)肺癌中差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，miR-412-5p在肺癌中高表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)miR-412-5p在肺癌中上調(diào)，表達(dá)量約為正常組織的4倍[5-6]，原鈣黏蛋白10(PCDH10)基因位于人類染色體4q28.3上，是一種腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤中下調(diào)表達(dá)[7]，研究發(fā)現(xiàn)PCDH10在肺癌中低表達(dá)，過表達(dá)PCDH10對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲具有抑制作用[8]，但miR-412-5p與PCDH10靶向關(guān)系尚未可知，本研究以肺癌細(xì)胞A549為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察miR-412-5p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute)、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PCDH10(貨號(hào)ab172709)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloprotease-2，MMP-2)(貨號(hào)ab86607)購(gòu)自Abcam公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(貨號(hào)51332)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(貨號(hào)2978)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(貨號(hào)14472)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(貨號(hào)bs-40296G-HRP)購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，miR-412-5p、anti-miR-412-5p、si-PCDH10及各自陰性對(duì)照購(gòu)自上海GenePharma公司，RIPA裂解液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 臨床組織標(biāo)本

46例肺癌組織及癌旁組織來源于河南省直第三人民醫(yī)院因肺癌而接受手術(shù)治療的患者。患者手術(shù)前未接受過任何放、化療的治療。實(shí)驗(yàn)前獲得每位患者的知情同意書，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。其中，癌旁組織為距離肺癌組織邊緣≥3 cm的正常組織。獲得樣本后立即置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，放在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行接種傳代。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)miR-412-5p表達(dá)

使用TRIzol試劑提取組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以制成的cDNA為模板，進(jìn)行qPCR反應(yīng)。miR-412-5p正向引物序列為5’-GGTACGGGGATGGATGGTC-3’，反向引物序列為5’-GGATACGGACGGCTAGTGGA-3’。內(nèi)參U6正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應(yīng)結(jié)束后，收集Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算miR-412-5p表達(dá)。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)

收集肺癌組織及癌旁組織標(biāo)本，用石蠟包埋切片，利用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP)試劑盒進(jìn)行染色，加入一抗4℃孵育過夜、二抗常溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察PCDH10蛋白表達(dá)并拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解液提取組織中的蛋白，測(cè)定蛋白含量后，吸取20 μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，加入5%脫脂牛奶封閉，之后加入1∶1 000稀釋的PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白一抗，同時(shí)加入1:1 000稀釋的GAPDH抗體作為內(nèi)參照，并于4℃孵育過夜，第2天用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(TBST)充分漂洗，之后加入1∶5 000稀釋的二抗，孵育1 h，曝光、顯色，分析PCDH10蛋白表達(dá)。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞板，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑說明書，分別將miR-412-5p、anti-miR-412-5p、si-PCDH10及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，依照1.4和1.5中的方法檢測(cè)miR-412-5p和PCDH10、Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá)。

1.8 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將1×104個(gè)/mL密度的A549細(xì)胞(轉(zhuǎn)染后)接種于96孔板，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入MTT溶液100 μL，孵育4 h，之后加入二甲基亞砜200 μL，搖床震蕩培養(yǎng)10 min，置酶標(biāo)儀讀取A549細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)處的吸光(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞遷移，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整A549細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，在上室加入200 μL。下室加入包含血清的培養(yǎng)基。孵育24 h，顯微鏡下拍照，并記錄遷移細(xì)胞數(shù)。Transwell檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞侵襲時(shí)，將無血清培養(yǎng)基與Matrigel基質(zhì)膠混勻，并加入上室，靜置3-4 h，其余步驟同細(xì)胞遷移檢測(cè)。

1.10 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶活性檢測(cè)

利用starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)工具預(yù)測(cè)miR-412-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)PCDH10的3’非編碼區(qū)域(3’UTR)含有miR-412-5p的互補(bǔ)序列。分別構(gòu)建包含miR-412-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型PCDH10-3’UTR(WT-PCDH10)或突變型(MUT-PCDH10)報(bào)告基因質(zhì)粒，將其與miR-412-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染。48 h根據(jù)雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒的指示，進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-412-5p、PCDH10在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)

qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，與癌旁組織組比較，肺癌組織中miR-412-5p表達(dá)量明顯增加(P<0.05，圖1A)。Western blot和免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織組比較，肺癌組織中PCDH10蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05，圖1B、圖1C)。

圖1 miR-412-5p、PCDH10在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)A：miR-412-5p的表達(dá) B：PCDH10蛋白的表達(dá) C:免疫組化染色圖注：與癌旁組織組比較，*P<0.05

2.2 抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響

在肺癌A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-412-5p，發(fā)現(xiàn)miR-412-5p表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于anti-miR-NC組(P<0.05，圖2A)，提示成功構(gòu)建抑制miR-412-5p的A549細(xì)胞。Transwell檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-412-5p較anti-miR-NC組顯著降低細(xì)胞A549遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05，圖2B、圖2C)。MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，與anti-miR-NC組比較，抑制miR-412-5p顯著提高24 h、48 h、72 h的細(xì)胞增殖抑制率(P<0.05，圖2D)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與anti-miR-NC組比較，抑制miR-412-5p明顯減少Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)量，而提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05，圖2E、圖2F)。

圖2 抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲的影響A：miR-412-5p的表達(dá) B、C：抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)的影響 D：抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549抑制率的影響E、F：抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05

2.3 miR-412-5p靶向、調(diào)控PCDH10

Starbase軟件預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCDH10的3’UTR含有miR-412-5p互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-412-5p明顯降低WT-PCDH10的熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，而對(duì)MUT-PCDH10的熒光素酶相對(duì)活性無明顯影響(圖3B)。與miR-NC組比較，miR-412-5p顯著減少PCDH10蛋白表達(dá)量；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-412-5p明顯提高PCDH10蛋白水平(P<0.05，圖3C、圖3D)。

圖3 miR-412-5p靶向、調(diào)控PCDH10A：PCDH10的3’UTR含有miR-412-5p互補(bǔ)的序列 B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) C、D：miR-412-5p調(diào)控PCDH10的表達(dá)注：與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05

2.4 抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖的影響

與anti-miR-NC組比較，抑制miR-412-5p顯著提高A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h的細(xì)胞增殖抑制率(P<0.05，圖4A),明顯提高PCDH10蛋白水平而減少Cyclin D1表達(dá)量(P<0.05，圖4B、圖4C)。

與anti-miR-412-5p和si-NC共轉(zhuǎn)染組比較，anti-miR-412-5p和si-PCDH10共轉(zhuǎn)染明顯降低A549細(xì)胞24 h、48 h、72 h的細(xì)胞增殖抑制率(P<0.05，圖4A)，明顯降低PCDH10蛋白水平及增加Cyclin D1表達(dá)量(P<0.05，圖4B、圖4C)。

2.5 抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較，抑制miR-412-5p顯著減少遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05，圖5A、圖5B)，明顯提高E-cadherin蛋白水平并減少M(fèi)MP-2表達(dá)量(P<0.05，圖5C、圖5D)。與anti-miR-412-5p和si-NC共轉(zhuǎn)染組比較，anti-miR-412-5p和si-PCDH10共轉(zhuǎn)染明顯增加遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(P<0.05，圖5A、圖5B)，顯著降低E-cadherin蛋白水平及增加MMP-2表達(dá)量(P<0.05，圖5C、圖5D)。

圖4 抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖蛋白表達(dá)的影響A：抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549抑制率的影響 B、C：抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549中PCDH10和增殖蛋白表達(dá)的影響注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-412-5p+si-NC組比較，#P<0.05

圖5 抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲及其蛋白表達(dá)的影響A、B：抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲的影響 C、D：抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響注：與anti-miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-412-5p+si-NC組比較，#P<0.05

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年，全球新增肺癌病例210萬例，死亡病例180萬例[9]。肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此，研究肺癌進(jìn)展的分子機(jī)制，探尋有效的治療策略對(duì)于肺癌的治療至關(guān)重要。既往研究表明，許多分子參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展，包括與miRNA相關(guān)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控的改變[10-11]，因此，本研究考察miR-412-5p對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并對(duì)其可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探索。

大量證據(jù)表明，miRNA通過結(jié)合靶mRNA的3’UTR區(qū)域，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等多種生物學(xué)過程，與包括肺癌在內(nèi)的多種人類腫瘤密切相關(guān)，如miR-135a-5p[12]、miR-512-5p[13]、miR-148a[14]。miR-412-5p是其中一種miRNA，研究表明，抑制miR-412-3p可降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。但關(guān)于miR-412-5p對(duì)肺癌細(xì)胞毒性作用的研究罕見報(bào)道。本研究利用qPCR檢測(cè)肺癌組織中miR-412-5p表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-412-5p表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。抑制miR-412-5p明顯降低肺癌細(xì)胞A549遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)(P<0.05)，而提高24 h、48 h、72 h的細(xì)胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白水平，說明miR-412-5p可能在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)腫瘤致癌基因，抑制其表達(dá)則抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，提示miR-412-5p可能成為肺癌診斷和治療的生物標(biāo)志物。

PCDH10已被證明是一種抑癌基因，可作為胰腺癌[16]、乳腺癌[17]、結(jié)直腸癌[18]等的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。報(bào)道指出，PCDH10的上調(diào)抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本實(shí)驗(yàn)的Western blot和免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，肺癌組織中PCDH10表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，與張潔等[8]等的研究一致。Starbase軟件預(yù)測(cè)出miR-412-5p與PCDH10的3’UTR具有靶向結(jié)合位點(diǎn)，猜想PCDH10可能是miR-412-5p的下游靶基因之一。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè)，即miR-412-5p可以靶向調(diào)控PCDH10表達(dá)。另外，抑制PCDH10能逆轉(zhuǎn)抑制miR-412-5p對(duì)細(xì)胞A549增殖、遷移、侵襲、Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)的抑制作用，以及逆轉(zhuǎn)其對(duì)E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。這些數(shù)據(jù)表明，靶向調(diào)控PCDH10表達(dá)是miR-412-5p影響肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的重要途徑之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，miR-412-5p在肺癌組織中明顯上調(diào)，PCDH10表達(dá)下調(diào)。抑制miR-412-5p表達(dá)顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控PCDH10表達(dá)有關(guān)，這為肺癌發(fā)病機(jī)制的深入研究提供了新的線索，也為肺癌的治療提供了潛在靶標(biāo)。