黎家奇，康曉風，李紅波，莫海珍，徐 丹，胡梁斌，帥 良，張 浩,*

（1.河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安 710021；3.賀州學院食品與生物工程學院，廣西賀州 542899）

花生是非常重要的產(chǎn)油產(chǎn)蛋白質(zhì)的經(jīng)濟作物[1]，原產(chǎn)于南美洲，廣泛種植于中國、非洲、印度、日本、美國等國家[2]。自20 世紀60 年代以來，黃曲霉毒素污染成為全世界花生產(chǎn)業(yè)所面臨的主要問題。黃曲霉毒素是黃曲霉菌的次生代謝物，會對人類和動物產(chǎn)生嚴重的毒副作用。受到黃曲霉毒素污染的花生因失去使用和加工性能造成重大的經(jīng)濟損失[3]?；ㄉa(chǎn)過程中的采前、收獲和采后儲藏各階段所存在的多種因素會造成花生中黃曲霉毒素的污染[4]。同時花生對黃曲霉污染的高度敏感性會導致黃曲霉毒素的進一步加劇污染。黃曲霉危害風險的早期識別與預警對于花生等農(nóng)產(chǎn)品的科學防控和安全保障具有重大作用和意義。

目前黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等，這些已廣泛用于食品和飼料中黃曲霉毒素的檢測[5?7]。這些方法往往存在操作步驟復雜、操作時間長、檢測靈敏度差等問題[4]，無損快速檢測目前尚不可行。隨著色譜和光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，食品工業(yè)中霉菌的鑒定已轉(zhuǎn)向檢測，諸如霉菌毒素和霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物等霉菌生長代謝產(chǎn)物[8]。微生物揮發(fā)性有機化合物（VOCs）是指細菌和真菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的初級或次級代謝揮發(fā)性化合物。黃曲霉在生長過程中消耗多種營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，釋放20 多種影響花生品質(zhì)和安全性的揮發(fā)性有機化合物[9?10]。微生物揮發(fā)性有機化合物是廣泛應用于臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測中的微生物生長評價指標，目前逐漸成為研究微生物污染的新型有效手段[11]。氣相色譜-離子遷移譜（GCIMS）監(jiān)測系統(tǒng)是目前研究常用的新型技術(shù)，使用該方法檢測揮發(fā)性有機化合物與電子鼻和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)相比，具有使用簡單、設備便攜、靈敏度高、樣品無需前處理等優(yōu)點[9]。目前該技術(shù)在食品中的應用主要集中在橄欖油、大米、蜂蜜和茶葉的質(zhì)量評價上，在花生霉菌檢測領域的研究較少[12?14]。

本研究利用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)對花生中霉菌生長的不同階段產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物進行了檢測和分析。利用特征指紋圖譜和熱圖聚類分析黃曲霉的侵染過程，使用主成分分析結(jié)合聚類分析尋找花生早期霉變的標識分子，探究該方法在花生霉變程度快速評估及早期預警中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉菌株CGMCC3.2890 中國微生物菌種保藏中心；沙氏培養(yǎng)基（1%蛋白胨、2%瓊脂和4%葡萄糖） 深圳子科生物科技有限公司；次氯酸鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

FA224 型電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；LHR-250-S 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；Flavour Spec 氣相-離子遷移譜風味分析儀 德國G.A.S 公司；FS-SE-54-CB-1 毛細管柱（15 m，內(nèi)徑：0.53 mm） 蘭州中科安泰分析科技有限責任公司；CTC-PAL 自動頂空進樣裝置瑞士CTC Analytics 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生侵染實驗 使用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)黃曲霉菌株（CGMCC3.2890）。使用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡花生1 min，無菌水洗滌3 次。然后將花生浸入約106個/mL 黃曲霉孢子懸浮液中10 s，接著置于無菌水瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，室溫下干燥后30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)并觀察黃曲霉侵染情況。未經(jīng)黃曲霉孢子污染的花生樣品作為對照組。樣品每24 h 采集一次，放置于20 mL 頂空進樣瓶儲存于?18 ℃冰箱。每個采樣時間節(jié)點采集三份樣品。

1.2.2 氣相色譜-離子遷移譜測定 采用氣相色譜-離子遷移譜風味分析儀對不同儲藏條件下花生中的揮發(fā)性化合物進行鑒定及相對定量分析。進樣針溫度65 ℃，賦予溫度60 ℃，溫育時間10 min，使用無分流模式解吸法注入樣品500 μL[15?17]。使用置于60 ℃的FS-SE-54-CB-1 毛細管柱（15 m，內(nèi)徑：0.53 mm），以氮氣為載氣進行色譜分離。在等溫條件下，使用載氣流動色譜分離，載氣流速從2 mL/min開始持續(xù)2 min，在8 min 內(nèi)增加到20 mL/min，在10 min 內(nèi)增加到100 mL/min，在10 min 時增加到150 mL/min。分析過程總計耗時30 min[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用儀器配套的功能分析軟件LAV（Laboratory Analytical Viewer）和配套三款插件以及GC×IMS Library Search 定性軟件，分別從不同角度對樣品進行分析[19]。使用設備自帶的LAV 分析軟件中Reporter、Gallery 和Dynamic PCA 插件程序和GC×IMS Library Search 構(gòu)建揮發(fā)性有機物的差異圖譜。同時為了，通過軟件中內(nèi)置的NIST 2014 氣相保留指數(shù)數(shù)據(jù)庫和G.A.S 的IMS 遷移時間數(shù)據(jù)庫對分析樣品材料進行二維定性分析[20?22]。同時使用熱圖和主成分分析進行樣本聚類分析[23]。使用R 軟件包pheatmap 構(gòu)建熱圖，factoextra 構(gòu)建主成分分析圖。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)性有機化合物氣相色譜-離子遷移譜圖

黃曲霉侵染花生過程中會消耗許多營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，形成各種揮發(fā)性有機化合物，對花生的品質(zhì)和安全性造成影響。通過使用氣相色譜-離子遷移譜對花生樣品中不同生長階段黃曲霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物進行差異分析，探究花生中黃曲霉不同侵染階段的特異揮發(fā)性有機化合物[23?24]。

花生樣品和黃曲霉侵染不同生長階段（不同采樣時間節(jié)點）樣品圖片和揮發(fā)性有機化合物3D 可視化圖譜如圖1A 所示。實驗結(jié)果表明P1 組與對照組相比并未觀察到明顯變化，P2 組侵染樣品出現(xiàn)輕微霉變現(xiàn)象，而P3～P5 組出現(xiàn)明顯的黃曲霉霉變現(xiàn)象。同時通過觀察3D 可視化圖譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)長時間的儲存導致某些化合物的含量降低，與此同時還觀察到新的揮發(fā)性有機化合物形成。以上結(jié)果表明在霉菌侵染花生期間霉菌可能通過代謝花生自身所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物或有機物質(zhì)產(chǎn)生霉菌自身代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物，導致儲存花生環(huán)境體系中出現(xiàn)不同揮發(fā)性有機化合物的消長。

圖1 花生樣品和霉菌不同生長階段的氣相色譜-離子遷移譜圖Fig.1 The GC-IMS topographic plots of peanuts samples and peanuts with different growth stages of mold

為進一步探究黃曲霉侵染不同生長階段的花生樣品中揮發(fā)性有機化合物消長規(guī)律，構(gòu)建分析如圖1B 氣相色譜-離子遷移譜測定的黃曲霉侵染不同生長階段的花生樣品中芳香化合物的二維圖譜。樣品采樣頂部空間中的總化合物和每個單獨的揮發(fā)性化合物分別由整個光譜和離子反應峰右側(cè)的點顯示。物質(zhì)信號強度用顏色顯示，白色和紅色分別表示低強度和高強度。圖1B 結(jié)果表明侵染過程中大多數(shù)揮發(fā)性化合物信號的漂移時間在1.0～1.8 s 的范圍內(nèi)，保留時間在100～450 s 的范圍內(nèi)。

隨后以P0 對照組譜圖作為參考譜圖，同時計算P0 參照譜圖和其他各組譜圖之間的差異構(gòu)建如圖1C所示。結(jié)果表明侵染實驗組P1～P5 樣品中的大多數(shù)揮發(fā)性有機化合物濃度信號遠高于P0 對照組參考譜圖，說明受侵染花生樣品中黃曲霉不同生長階段產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物具有較大差異。對不同侵染階段差異揮發(fā)性有機化合物進行有效區(qū)分是作為后期判斷黃曲霉污染花生和污染程度的重要指標。

2.2 揮發(fā)性有機化合物物質(zhì)鑒定

前期實驗發(fā)現(xiàn)不同侵染階段揮發(fā)性有機化合物種類和濃度具有明顯差異，其中某種化合物也可能會以單體形式、二聚體形式或多聚體形式存在產(chǎn)生斑點或多種信號，造成譜圖差異，具體取決于實際濃度和化合物性質(zhì)。可通過鑒定不同侵染階段揮發(fā)性有機化合物種類確定其成分來加以區(qū)分和判斷，使用GC-IMS 自帶的Library Search 軟件將揮發(fā)性有機化合物的離子遷移譜漂移時間和保留指數(shù)與數(shù)據(jù)庫中參考有機化合物數(shù)據(jù)比對進行組分分析[25?26]。最終從樣品53 個峰中鑒定出34 種化合物單體及部分物質(zhì)的二聚體，同時檢測到有19 種目前尚無法確定具體物質(zhì)的信號。各組樣品中化合物種類相似度較高，圖2 以樣品P1 為例對其中的化合物進行定性分析。圖2 化合物編號與表1 化合物編號一一對應。表1 展示了全部53 種化合物名稱、CAS 編號、分子式、分子量、保留指數(shù)、保留時間和漂移時間及暫時無法定性分析確定的C1～C19 物質(zhì)。

圖2 霉變花生樣品的離子遷移譜Fig.2 Ion mobility spectra of moldy peanut

表1 霉變花生樣品中鑒定化合物的信息Table 1 Information on the identified compounds in moldy peanuts

續(xù)表1

2.3 揮發(fā)性有機化合物指紋圖譜與熱圖聚類分析

為了更加直觀地觀察樣品侵染過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律和相對含量變化，借助 Gallery Plot 插件繪制揮發(fā)性物質(zhì)的指紋譜圖，直觀比較了不同樣品之間的揮發(fā)性有機化合物差異。如圖3 所示為繪制黃曲霉菌侵染花生（從第0～5 d）樣品中揮發(fā)性有機化合物種類和濃度的差異指紋圖譜。每種芳香化合物的信號強度表示其濃度水平[27]。由結(jié)果可知，a 區(qū)域P0 樣品中糠醛、異戊酸、二氫-2-呋喃酮、C3、C4 和C5 的信號強度很強；b 區(qū)域3-甲基丁醛、苯乙醛、戊-1-醇、壬醛、戊-2-壬醛、己醛、2，3-丁二酮和己酸等揮發(fā)性有機化合物主要存在于霉變早期階段樣品P1～P3 中；辛-1-烯-3-醇、2-庚酮、3-甲基磺?；?丙醇、戊-2，4-庚二烯醛、戊-2-辛烯醛、2-辛酮、C1、C2 和C14～C18 等c 區(qū)域中的揮發(fā)性有機化合物在侵染后期P4，P5 樣品中的濃度高于在樣品P0～P3 中的濃度。結(jié)果表明實驗組所設置不同侵染階段揮發(fā)性有機化合物差異明顯，具有明顯區(qū)分度，為后續(xù)進一步的產(chǎn)品監(jiān)測提供可能。

圖3 花生樣品揮發(fā)性成分的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of the volatile compounds of the peanut samples

通過揮發(fā)性有機化合物的聚類分析以直觀地比較不同化合物之間的差異性和相似性[28]。聚類分析結(jié)果如圖4 所示，將5 個花生樣品組分為3 組：對照組（P0），霉變前期階段（P1～P2）和霉變后期階段（P3～P5）；將樣品中的揮發(fā)性化合物分為四類：a 類、b 類、c 類和d 類。其中a 組揮發(fā)性有機化合物主要存在于對照組P0，b 組和d 組揮發(fā)性有機化合物主要產(chǎn)生于霉變后期組（P3～P5），c 組揮發(fā)性有機化合物主要產(chǎn)生于霉變前期組（P1～P2），所設置樣品組和揮發(fā)性有機化合物組具有較好的代表性。

圖4 花生樣品中揮發(fā)性化合物的熱圖聚類分析Fig.4 Heat map and cluster analysis of volatile compounds from the peanut samples

圖3 和圖4 結(jié)果表明P0 對照樣品組中異戊酸、二氫-2-呋喃酮、正己醇-D、C3、C4、C5、C7 和C13 的信號遠高于被黃曲霉侵染的樣品組。P0 對照樣品組中幾乎沒有2-己烯-1-醇-M、戊-1-醇-M、己醛、己酸、2，3-丁二酮、C6 和C8 等揮發(fā)性有機化合物檢出。但這些揮發(fā)性有機化合物的信號在P1～P2 霉變前期階段最強，同時信號強度隨著霉菌生長時間的延長而減弱。而P4～P5 霉變后期階段樣品中主要檢出有戊-庚-2-烯醛-D、戊-2-辛烯醛-D、2-辛酮-D、2-庚酮-D、辛-1-烯-3-醇、2-辛酮-M、3-甲基丁-1-醇、庚醇、3-甲基磺?；?丙醇和乙酸乙酯等揮發(fā)性有機化合物。結(jié)果表明在整個霉變過程中，樣品中揮發(fā)性有機化合物的種類逐漸增加，不同霉變階段有其獨特的揮發(fā)性有機化合物。其中c 類化合物和d 類化合物是實現(xiàn)花生樣品霉變早期監(jiān)測和預警的重要分子標志物。

2.4 揮發(fā)性有機化合物主成分分析

進一步分析所得數(shù)據(jù)結(jié)果，通過分析數(shù)據(jù)變化并集中可視化數(shù)據(jù)進行主成分分析[29?30]。如圖5 A 是根據(jù)整個數(shù)據(jù)分析所得的主成分分析數(shù)據(jù)，將主成分分為1 和2 兩部分。其中主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的主成分分析雙標圖占數(shù)據(jù)集總方差的95%。PC1 在數(shù)據(jù)中占87.2%的方差，PC2 占7.8%的方差。將主成分分析結(jié)果劃分為四個不同的區(qū)域，其中a 區(qū)包括P0 對照，b 區(qū)包括P1 和P2 霉變早期階段，c 區(qū)包括P3 霉變中期階段，d 區(qū)包括P4 和P5 霉變后期階段。c 區(qū)域和d 區(qū)域樣品之間的揮發(fā)性有機化合物濃度出現(xiàn)高度的相似性，但b 區(qū)域和其他區(qū)域具有顯著差異。該主成分分析結(jié)果與前期聚類分析熱圖結(jié)果類似。

使用主成分載荷圖篩選識別對不同主成分聚類貢獻最大的揮發(fā)性有機化合物繪制圖5 B。其中向量的方向和長度表示變量對兩個主成分的貢獻程度。發(fā)現(xiàn)C9 幾乎平行于Y 軸，表明C9 是導致主成分1 差異的主要因素。對揮發(fā)性有機化合物之間的相似性進行分析繪制圖5 C，結(jié)果表明花生樣品中黃曲霉生長前期（P1～P2）與生長中后期（P3～P5）的差異較大，霉菌侵染早期階段P1，P2 的花生樣品可以與對照組P0 較好地區(qū)分開，此結(jié)果為花生中黃曲霉污染的早期監(jiān)測與預警提供可能。

圖5 花生樣品揮發(fā)性成分的主成分分析及相似性分析Fig.5 PCA and similarity analysis of VOCs from the peanut samples

3 結(jié)論

所有真菌在其生理活動過程中都會產(chǎn)生并排放揮發(fā)性有機化合物，但每種真菌排放的揮發(fā)性有機化合物的數(shù)量和質(zhì)量組成均不同[31]。本研究采用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)，在不需樣品前處理的情況下，從受黃曲霉污染的花生中鑒定出53 種揮發(fā)性化合物，其中包含有很多目前尚未見報道和未能確定的組分，這部分未知物質(zhì)（C1～C19）需要后續(xù)進一步研究。實驗結(jié)果表明在霉菌不同的生長階段，花生樣品中的風味物質(zhì)豐度和組成差異很大，為后續(xù)利用不同侵染階段風味物質(zhì)豐度和組成差異判斷及區(qū)分花生產(chǎn)品質(zhì)量與安全問題提供了可行的方法。

本研究首次報道了利用氣相色譜-離子遷移譜結(jié)合指紋圖譜分析、主成分分析和譜圖評價受黃曲霉污染的儲存花生中揮發(fā)性有機化合物的成分、豐度和組成差異。通過聚類分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)霉菌不同生長階段出現(xiàn)不同的揮發(fā)性有機化合物成分。其中己酸、2，3-丁二酮、2-己烯-1-醇、戊-1-醇、己醛、C6 和C8 化合物在霉菌感染早期豐度最強，并且其濃度信號隨著生長時間的增加而減弱。KARLSH?J等[32]曾研究發(fā)現(xiàn)某些真菌毒素合成過程中會釋放揮發(fā)性化合物乙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇丙酮、2-丁酮和2-戊酮等，可通過電子鼻監(jiān)測來預測真菌污染。LI 等[33]使用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)研究了玉米霉變過程中揮發(fā)化合物變化，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和3-羥基丁烷-2-酮可以作為玉米被黃曲霉菌感染的早期預警分子。ZHANG 等[34]指出CO2 和過氧化氫酶可作為玉米儲藏過程中受真菌毒素污染的預警指示分子?？梢?，黃曲霉侵染不同的糧食作物可能產(chǎn)生特異性的揮發(fā)化合物。本研究為倉儲條件花生早期霉菌污染的氣體監(jiān)測傳感器研制提供了有效監(jiān)測靶點分子，可基于這些標識分子設計倉儲條件下的花生霉變實時在線監(jiān)測和預警系統(tǒng)[33]。同時本研究樣品采樣檢測過程中不需外加處理過程，采集倉儲環(huán)境揮發(fā)性有機化合物氣體即可高效敏捷監(jiān)測農(nóng)產(chǎn)品，為花生早期霉變預警監(jiān)測提供了新思路，具有極大的應用前景。