張香港，何谷良，趙 澄，陳純靜，肖 榮，胡 玨，魏 科，李 玲，寧 毅，盧芳國

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000）

流行性感冒是由流感病毒感染引起的季節(jié)性急性呼吸道傳染病，在中醫(yī)學(xué)中屬外感熱病之瘟病、疫病范疇[1]，它的發(fā)生發(fā)展是流感病毒的致病作用與抗病毒免疫應(yīng)答作用相互影響和制約的結(jié)果。流感病毒進(jìn)入不同機(jī)體后，病毒的增殖不僅可直接破壞宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝，導(dǎo)致組織炎癥和病理改變，還會(huì)因機(jī)體免疫反應(yīng)過度而引起廣泛的免疫病理損傷。免疫病理損傷是流感病毒的重要致病機(jī)制[2]。有研究證實(shí)，流感病毒經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體后，能促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞炎癥因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等）和趨化因子（如CCL2、CCL3、CXCL10等）大量分泌，過度分泌的細(xì)胞因子進(jìn)一步造成嚴(yán)重的肺損傷[3-4]。肺泡灌洗液中CXCL10的含量水平與H1N1流感病毒導(dǎo)致肺組織的病理損傷程度呈正相關(guān)[5-6]。中醫(yī)藥在流行性感冒治療中應(yīng)用廣泛并有著獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7]。麻杏石甘湯源于《傷寒論》，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，該方具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用，對(duì)咳嗽、支氣管炎、肺炎、哮喘等多種疾病具有良好的治療效果，并廣泛用于流行性感冒熱毒襲肺證和熱毒壅肺證的治療[8]。本課題組前期研究表明麻杏石甘湯能夠通過調(diào)節(jié)趨化因子CCL5和CXCL10等的表達(dá)水平而發(fā)揮抗流感病毒作用[9]。筆者在前期研究基礎(chǔ)上，以小鼠肺巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，從TLR2/TLR4介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)水平進(jìn)一步研究其抗流感病毒的分子機(jī)制。

1 材 料

1.1 病毒株A型流感病毒（A/PR/8/34）小鼠肺適應(yīng)株由湖南師范大學(xué)病毒研究室提供，-80℃保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室。病毒原液經(jīng)稀釋108倍后接種于10 d齡雞胚尿囊腔培養(yǎng)傳代，血凝效價(jià)1∶640用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自中南大學(xué)湘雅細(xì)胞中心，本實(shí)驗(yàn)室傳代后使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-000，常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)屏障環(huán)境，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度25℃，濕度60%，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2015-003。本實(shí)驗(yàn)過程中涉及的大鼠處理措施均已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 藥物與試劑 麻杏石甘湯方藥組成：麻黃9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g。麻黃（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號(hào)：1712052）、杏仁（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1712170062）、生石膏（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1706110212）、炙甘草（安徽亳藥千草國藥股份有限公司，批號(hào)：1707025）均購于湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院門診部，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部戴冰教授鑒定均為2015年版《中華人民共和國藥典》收錄正品。磷酸奧司他韋膠囊（上海羅氏，批號(hào)：M1036）；抗病毒口服液（廣州香雪制藥股份有限公司，批號(hào)：201705007）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號(hào)：2232246）；0.25%胰酶（美國Gibco公司，批號(hào)：2120734）；Lipopolysaccharides（美國Sigma公司，貨號(hào)：L2630）；Sparstolonin B（美國Sigma公司，貨號(hào)：SML1767）；Pam3csk4（美國InvivoGen公司，貨號(hào)：tlrl-pms）；IL-1 ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號(hào)：TE20171110012）；IL-8 ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號(hào)：TE20171110121）；TNF-α ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號(hào)：TA20171108003）；TLR2抗體（美國Abcam公司，批號(hào)：GR3188234-5）；TLR4抗體（美國Abcam公司，批號(hào)：GR310706-5）。

1.5 主要儀器3111CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、1300生物安全柜（美國Thermo Scientific）；ELx800酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；光學(xué)掃描顯微鏡（Axioscope 5）+Axiocam 503 color顯微鏡攝像頭（蔡司科技有限公司）。

2 方 法

2.1 麻杏石甘湯水煎液的制備 參考《傷寒論》[10]及前期研究結(jié)果[11]，按其組成比例分別稱量7劑的藥材量。先稱取63 g麻黃，加入藥材總量10倍體積的蒸餾水，武火煎煮，待沸騰后，調(diào)整為文火煎煮25 min，去沫，再加入石膏126 g、杏仁63 g、甘草42 g，繼續(xù)文火煎煮30 min，煎煮完畢后濾過；二煎加入7倍體積蒸餾水武火煮沸后再文火煎煮20 min，煎煮完畢后濾過，混勻2次藥液濃縮至含生藥4.26 g/mL，避光保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 含藥血清的制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組，每組10只。按動(dòng)物體表面積與劑量換算法[12]，以60 kg人體每日服用藥物劑量與200 g大鼠體表面積換算得到各藥物組臨床等效劑量。按5倍臨床等效劑量灌胃給藥，計(jì)算出各藥物組的給藥劑量為：奧司他韋38.08 mg/（kg·d）、抗病毒口服液15.23 mL/（kg·d）、麻杏石甘湯21.32 g/（kg·d）。各藥物組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物1 mL，正常對(duì)照組予以相同體積生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后禁食2 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠后行腹主動(dòng)脈采血，靜置后以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，再次離心上清液后用0.22 μm的除菌器濾過后分裝成2 mL/支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 含藥血清對(duì)肺巨噬細(xì)胞活性影響的檢測 小鼠肺巨噬細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL，移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔接種100 μL）培養(yǎng)12 h后分組。實(shí)驗(yàn)設(shè)正常培養(yǎng)組（加10%胎牛血清）、空白血清組（分別加40%、20%、10%、5%大鼠空白血清）、奧司他韋含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%奧司他韋大鼠含藥血清）、抗病毒口服液含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%抗病毒口服液大鼠含藥血清）、麻杏石甘湯含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%麻杏石甘湯大鼠含藥血清），每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后棄培養(yǎng)液，用MTT法檢測細(xì)胞活性。

2.4 含藥血清對(duì)A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞TLR2/TLR4介導(dǎo)的IL-1、IL-8、TNF-α分泌水平影響的檢測 小鼠肺巨噬細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔接種100 μL），實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、TLR2激活劑（Pam3csk4）組、TLR4激活劑（LPS）組、TLR2/4抑制劑（SsnB）組、病毒對(duì)照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組。每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至孔板的60%時(shí)，病毒對(duì)照組和各藥物組加入稀釋倍數(shù)為100倍的病毒，各組均更換相應(yīng)干預(yù)因素的10%胎牛血清培養(yǎng)液或10%相應(yīng)含藥血清DMEM高糖200 μL進(jìn)行培養(yǎng)，各干預(yù)因素作用24、48 h后收集細(xì)胞上清液。用ELISA試劑盒檢測IL-1、IL-8、TNF-α的分泌水平。

2.5 含藥血清對(duì)A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平影響的檢測 小鼠肺巨噬細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL。將細(xì)胞懸液接種于已經(jīng)加無菌圓形蓋玻片的24孔板（每孔接種200μL），實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組、TLR2激活劑（Pam3csk4）組、TLR4激活劑（LPS）組、TLR2/4抑制劑（SsnB）組、病毒對(duì)照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組。每組平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至孔板的60%時(shí)，病毒對(duì)照組和各藥物組加入稀釋倍數(shù)為100倍的病毒，各組均更換相應(yīng)干預(yù)因素的10%胎牛血清培養(yǎng)液或10%相應(yīng)含藥血清DMEM高糖200 μL進(jìn)行培養(yǎng)，各干預(yù)因素作用24 h后棄上清液，用PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定，將固定好的細(xì)胞用PBS清洗后，經(jīng)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加適量TLR2、TLR4一抗孵育、二抗孵育，DAB顯色，復(fù)染，梯度脫水，透明，封片后，鏡下觀察結(jié)果。細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色為陽性表達(dá)。每張樣本切片在高倍鏡下（×400），隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-Pro Plus 5.0軟件計(jì)算視野的平均光密度值，作為該樣本的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0處理分析。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組比較，對(duì)樣本先進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，使用單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行組間的多重比較，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 含藥血清對(duì)肺巨噬細(xì)胞活性的影響 在含藥血清干預(yù)24 h后，濃度為40%、20%、10%、5%的各含藥血清組（奧司他韋含藥血清組、抗病毒口服液含藥血清組、麻杏石甘湯含藥血清組）肺巨噬細(xì)胞活性與正常培養(yǎng)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明各含藥血清對(duì)肺巨噬細(xì)胞活性無顯著性影響。在含藥血清干預(yù)48 h后，10%的奧司他韋含藥血清組肺巨噬細(xì)胞活性與正常培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各含藥血清組肺巨噬細(xì)胞活性明顯高于正常培養(yǎng)組（P<0.01）。說明各濃度含藥血清組對(duì)肺巨噬細(xì)胞均無毒性。本實(shí)驗(yàn)選擇10%濃度的含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（見表1）

表1 各組肺巨噬細(xì)胞活性比較±s，n=3）

表1 各組肺巨噬細(xì)胞活性比較±s，n=3）

24 h 48 h OD值 細(xì)胞活力（%）OD值 細(xì)胞活力（%）正常培養(yǎng)組 10% 1.55±0.21 100.00 0.59±0.07 100.00空白血清組 40% 1.51±0.13 97.41 0.87±0.09a 147.75 20% 1.70±0.08 109.67 0.86±0.07a 145.76 10% 1.55±0.21 100.00 0.84±0.01a 142.37 5% 1.55±0.73 100.00 0.87±0.01a 147.75奧司他韋含藥血清組 40% 1.45±0.19 93.54 0.86±0.03a 145.76 20% 1.43±0.26 92.25 0.80±0.07a 135.59 10% 1.57±0.26 101.29 0.58±0.07 98.30 5% 1.68±0.11 108.38 0.76±0.03a 128.81抗病毒口服液含藥血清組 40% 1.54±0.58 99.35 0.91±0.02a 154.23 20% 1.67±0.03 107.74 0.84±0.10a 142.37 10% 1.44±0.12 92.90 0.92±0.07a 155.93 5% 1.35±0.10 87.09 0.97±0.03a 164.40組別 血清濃度

續(xù)表1：

3.2 含藥血清對(duì)A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞TLR2/4介導(dǎo)的IL-1、IL-8、TNF-α分泌水平的影響

3.2.1 各組肺巨噬細(xì)胞IL-1的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對(duì)照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對(duì)照組肺巨噬細(xì)胞IL-1含量明顯升高（P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細(xì)胞IL-1含量與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對(duì)照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細(xì)胞IL-1含量明顯降低（P＜0.01）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細(xì)胞IL-1含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在含藥血清干預(yù)48 h后，各組間肺巨噬細(xì)胞IL-1含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖1）

圖1 各組肺巨噬細(xì)胞IL-1含量比較s，n=4）

3.2.2 各組肺巨噬細(xì)胞IL-8的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對(duì)照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、TLR2/4抑制劑組、病毒對(duì)照組肺巨噬細(xì)胞IL-8含量明顯升高（P＜0.01）；與病毒對(duì)照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細(xì)胞IL-8含量明顯降低（P＜0.01）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細(xì)胞IL-8含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在含藥血清干預(yù)48 h后，各組間肺巨噬細(xì)胞IL-8含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖2 各組肺巨噬細(xì)胞IL-8含量比較s，n=4）

3.2.3 各組肺巨噬細(xì)胞TNF-α的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對(duì)照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對(duì)照組肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量明顯升高（P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對(duì)照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在給藥48 h后，各組間肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3）

圖3 各組肺巨噬細(xì)胞TNF-α含量比較s，n=4）

3.3 含藥血清對(duì)A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平的影響 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對(duì)照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對(duì)照組肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)平均光密度值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)平均光密度值與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對(duì)照組比較，奧司他韋組、麻杏石甘湯組肺巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)平均光密度值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），麻杏石甘湯組肺巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)平均光密度值明顯降低（P＜0.05）。（見表2、圖4～5）

表2 各組肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)平均光密度值±s，n=3）

表2 各組肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)平均光密度值±s，n=3）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與病毒對(duì)照組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 TLR2 TLR4正常對(duì)照組 0.24±0.16 0.12±0.04 TLR2激活劑組 0.32±0.25a 0.29±0.02b TLR4激活劑組 0.32±0.44a 0.29±0.08b TLR2/4抑制劑組 0.24±0.14 0.12±0.01病毒對(duì)照組 0.34±0.06b 0.24±0.01b奧司他韋組 0.23±0.03d 0.18±0.03抗病毒口服液組 0.30±0.01 0.18±0.04麻杏石甘湯組 0.26±0.04c 0.14±0.03c F 4.241 8.278 P 0.008 0.000

圖4 含藥血清干預(yù)24 h各組小鼠肺巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平（免疫組化，×400）

圖5 含藥血清干預(yù)24 h各組小鼠肺巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)水平（免疫組化，×400）

4 討 論

流感病毒感染機(jī)體后，機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒作用，主要表現(xiàn)為急性呼吸道感染癥狀，部分患者尤其是免疫功能低下或免疫功能紊亂的兒童及老人可表現(xiàn)為急性肺損傷（acute lung injury，ALI），甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），導(dǎo)致呼吸衰竭和多器官損傷。盡管目前流感病毒導(dǎo)致ARDS的機(jī)制尚未完全闡明，但病毒感染所致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”與肺損傷的相關(guān)性已被普遍認(rèn)同?！凹?xì)胞因子風(fēng)暴”是指機(jī)體免疫系統(tǒng)被過度激活而引起趨化因子和促炎性細(xì)胞因子的過度釋放。過度釋放的細(xì)胞因子在清除病原體的同時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起組織器官功能紊亂、衰竭乃至機(jī)體死亡。

單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞是重要的先天免疫細(xì)胞，其對(duì)增強(qiáng)機(jī)體防御、促進(jìn)組織發(fā)育和維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的作用，并且是機(jī)體防御病原體入侵的第一道防線。巨噬細(xì)胞通過其表面受體識(shí)別病原體，經(jīng)吞噬、消化及抗原提呈作用后，促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞因子的表達(dá)來抵抗病原體入侵。Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是介導(dǎo)天然免疫的重要膜分子，其能識(shí)別病原微生物中的進(jìn)化保守分子結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)至少存在13個(gè)TLRs家族成員，其中TLR2、TLR4高表達(dá)于巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面。TLR2/TLR4能監(jiān)視與識(shí)別疾病相關(guān)分子模式而啟動(dòng)信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。流感病毒感染機(jī)體后，表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面的TLR2、TLR4分子識(shí)別并結(jié)合病毒蛋白而啟動(dòng)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)[14]。細(xì)胞因子對(duì)抑制病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫具有重要的作用，但過度的細(xì)胞因子表達(dá)與分泌則會(huì)導(dǎo)致免疫病理損傷。因此，調(diào)節(jié)Toll樣受體表達(dá)與活化水平及其下游細(xì)胞因子的分泌是藥物抗流感病毒的效應(yīng)機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞24 h后細(xì)胞上清液IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯升高，同時(shí)細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平明顯升高，說明A型流感病毒可通過激活TLR2/TLR4信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子IL-1、IL-8、TNF-α的分泌導(dǎo)致肺組織免疫病理損傷。

麻杏石甘湯源于《傷寒論》，是治療外感熱病的常用方。方中麻黃辛苦溫，宣肺解表而平喘；石膏辛甘大寒，清瀉肺胃之熱以生津，兩藥相輔，共為君藥。石膏倍于麻黃制麻黃溫?zé)嶂?，使整方不失為辛涼之劑，麻黃得石膏則宣肺平喘而不助熱。臣藥杏仁降利肺氣而平喘，與麻黃宣降相因。佐藥甘草調(diào)和諸藥。四藥共奏辛涼宣肺、清熱平喘之效。該方在國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《流行性感冒診療方案（2019年版）》及《流行性感冒診療方案（2020年版）》中被推薦為治療流感熱毒襲肺證、熱毒壅肺證的基礎(chǔ)處方[15-16]。研究表明該方對(duì)TLR4、TLR7/8介導(dǎo)的TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-α/β蛋白表達(dá)水平有調(diào)節(jié)作用，并能夠下調(diào)趨化因子CCL3、CCL25的蛋白表達(dá)水平而緩解流感病毒感染小鼠后引起的肺部免疫病理損傷[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯含藥血清干預(yù)24 h可明顯降低A型流感病毒刺激的肺巨噬細(xì)胞上清液中IL-1、IL-8、TNF-α含量，并明顯降低肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平，說明該方可通過調(diào)節(jié)A型流感病毒感染肺巨噬細(xì)胞TLR2、TLR4表達(dá)水平進(jìn)而影響炎癥因子的分泌水平，這可能是其抗病毒作用的效應(yīng)機(jī)制之一。本研究可為該方治療流感的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)，然而，麻杏石甘湯的有效成分復(fù)雜，除TLR2/TLR4信號(hào)通路外，該方可否通過其他途徑調(diào)節(jié)流感病毒感染導(dǎo)致的炎癥因子的分泌水平有待進(jìn)一步研究，其抗流感病毒作用的其他靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步挖掘。