胡盛琳 晏小蓉 黃翔悅 張雪娟

(1.雅安市人民醫(yī)院，四川 雅安 625000；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

鼻粘膜損傷主要由外傷、放射治療、慢性感染(鼻竇炎或鼻竇手術(shù)術(shù)后感染)、變態(tài)反應(yīng)及藥物損傷等多種因素引起。主要表現(xiàn)為鼻腔黏膜，黏膜下組織充血腫脹等癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致并發(fā)癥，如粘連癥、骨炎或纖維化，額竇炎等[1-3]。鼻損傷或鼻部創(chuàng)面愈合的術(shù)后處理常使用鼻腔噴霧劑、鼻腔填塞劑、給予抗生素或糖皮質(zhì)激素等藥物。中藥在治療各種鼻損傷或促進(jìn)鼻黏膜創(chuàng)面愈合中也扮演著重要角色[1,4]。紫草素是紫草的主要活性成分，屬于萘醌類化合物[5]。藥理學(xué)研究顯示，紫草素有抗氧化、抗血栓、抗炎、抗菌和促進(jìn)傷口愈合作用，能顯著改善關(guān)節(jié)炎外觀和減少軟骨破壞；在急性潰瘍性腸炎誘導(dǎo)的小鼠模型中，紫草素可改善糞便外觀，防止血便和結(jié)腸、直腸縮短，改善增重[6]。紫草素及其衍生物體外抗菌活性顯示，其對(duì)甲氧西林敏感和耐藥金黃色葡萄球菌、萬古霉素敏感和耐藥糞腸球菌具有較強(qiáng)抗菌活性[7]。本研究以SD大鼠鼻黏膜機(jī)械損傷模型為對(duì)象，觀察了紫草素對(duì)鼻黏膜損傷的修復(fù)作用，旨在為該藥應(yīng)用于各種鼻炎及鼻腔術(shù)后黏膜快速修復(fù)和保健提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 藥物與主要試劑 紫草素采用超聲輔助乙醇提取法從新疆紫草干燥根提取，采用堿提酸沉淀法純化獲得，純度 ≥96%；紫草素溶液配制用0.5%二甲基亞砜做溶劑；紅霉素軟膏，規(guī)格：1%×10g，為上海通用藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；氯化鈉等試劑購自成都市科龍化工試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SD大鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，體重180～220 g，雌雄各半，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(川)2015-030，實(shí)驗(yàn)前在標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。大鼠處理符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 大鼠鼻黏膜機(jī)械性損傷模型的制備及分組給藥 將鼻部健康的SD大鼠用乙醚麻醉后，用手固定大鼠鼻部，酒精消毒后用刮匙在鼻甲中部鼻中隔面由后至前刮5次，傷及黏膜及黏膜下組織，但不傷及軟骨[8-9]。以鼻黏膜出血、血痂、紅腫、血管擴(kuò)張，以及顯微鏡觀察為黏膜上皮細(xì)胞及纖毛排列紊亂，充血、水腫為鼻黏膜損傷的判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。將60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組各12只，分別為紫草素高(4 mg/kg)、中(2 mg/kg)、低劑量組(1 mg/kg)，陽性藥物對(duì)照組(紅霉素軟膏)及模型對(duì)照組。每組大鼠鼻黏膜造成機(jī)械性損傷消毒后，立即使用藥物處理。紫草素組大鼠鼻腔按相應(yīng)給藥劑量給予紫草素溶液滴鼻；陽性藥物對(duì)照組大鼠鼻腔涂抹0.1m紅霉素軟膏(使用10μL槍頭吸取軟膏輕輕涂抹鼻腔)；模型對(duì)照不作任何處理。每天在固定時(shí)間給藥，連續(xù)用藥21天。

1.4 指標(biāo)觀察 用藥后每天觀察每組動(dòng)物的精神狀態(tài)，飲食情況及鼻部癥狀。在給藥第7、14、21天時(shí)從每組中分別隨機(jī)抽取4只動(dòng)物，乙醚麻醉后，耳內(nèi)鏡觀察鼻腔黏膜形態(tài)后處死動(dòng)物，剝離其頭部皮膚、肌肉，用眼科剪將鼻腔上方的骨骼分離，將鼻甲、鼻中隔充分暴露于視野，隨后將鼻中隔兩側(cè)的鼻粘膜輕輕剝離后取出，置于4%多聚甲醛固定24h后脫水，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡200倍下觀察組織病理學(xué)變化。在400倍下，每個(gè)樣本選取三個(gè)視野拍照，隨后運(yùn)用Image pro plus軟件分別對(duì)鼻腔上皮、固有層進(jìn)行中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況、鼻部表現(xiàn)特征情況及鼻黏膜組織病理學(xué)情況 不同組別大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的一般情況、鼻部表現(xiàn)特征情況及鼻黏膜組織病理學(xué)情況比較,見表1。在不同觀察時(shí)間點(diǎn)各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)圖片,見圖1。

圖1 在實(shí)驗(yàn)第7天、14天 和21天時(shí)各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)觀察(400×)

表1 不同組別大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的一般情況、鼻部表現(xiàn)特征情況及鼻黏膜組織病理學(xué)情況比較

2.2 大鼠鼻粘膜上皮中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)情況 第14天紫草素低劑量組及中劑量組鼻黏膜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)鼻黏膜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)模型組與紫草素不同劑量組組間相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在第14d紫草素低劑量組及中劑量組鼻黏膜淋巴細(xì)胞與模型組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)模型組與紫草素不同劑量組間相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陽性組與紫草素不同劑量組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同劑量紫草素組在不同觀察時(shí)間中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且紫草素劑量越高，觀察到的大鼠鼻黏膜上皮的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越低。

3 討論

鼻黏膜損傷可能是炎癥刺激，手術(shù)等外傷造成，在病理情況下，主要表現(xiàn)為纖毛排列紊亂、部分脫落，固有層增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化[1,3]。鼻黏膜損傷模型制備主要有鼻黏膜輻射損傷模型[4，11]；藥物性，如減充血?jiǎng)?dǎo)致鼻黏膜損傷[9]；大氣顆粒PM10造成鼻黏膜急性損傷[12]。本次采用刮匙在SD大鼠鼻黏膜反復(fù)劃刮制備鼻黏膜機(jī)械性損傷模型[10,13]。結(jié)果表明，該模型制備操作簡(jiǎn)單，安全，不會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，均能觀察到模型組大鼠鼻黏膜的損傷，如紅腫、血管充血、出血和潰瘍，以及柱狀上皮細(xì)胞變性壞死，纖毛倒伏，白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的病理變化。以上說明機(jī)械損傷可以作為制備鼻黏膜損傷模型的常規(guī)方法，可在實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

紫草為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是紫草科植物(新疆紫草、滇紫草或蒙紫草)的干燥根。性味甘、咸、寒，歸心、肝經(jīng)。功效清熱涼血、透疹消斑、活血解毒。主治血熱毒盛，斑疹、麻疹不透，濕疹，瘡瘍，燙傷等[14]。紫草素為紫草最主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究限制紫草素及其衍生物具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等廣泛藥理活性[8]。紫草素抗炎作用研究顯示了紫草素通過抑制毛細(xì)血管擴(kuò)張，降低通透性，減少滲出、緩解炎性腫脹，對(duì)急性和亞急性炎性動(dòng)物模型有顯著抗炎作用，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其高劑量(4mg/kg)組抗炎效果與地塞米松一致[15]。本研究前曾觀察了不同劑量紫草素對(duì)小鼠熱水甩尾潛伏期、小鼠熱板痛閾值的影響，以及對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹、小鼠瓊脂肉芽腫、醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響。前期研究顯示紫草素具有明顯的鎮(zhèn)痛和抗炎作用(實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未發(fā)表)?；谧喜菟孛黠@的鎮(zhèn)痛、抗炎活性，本研究觀察了紫草素對(duì)SD大鼠鼻黏膜損傷的修復(fù)作用。

表2 不同組別大鼠鼻黏膜上皮在不同觀察時(shí)間中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)情況比較

研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)第7天，不同劑量紫草素均能改善鼻損傷SD大鼠臨床表現(xiàn)，具體表現(xiàn)為用藥后大鼠鼻孔流血，流涕和抓撓鼻部現(xiàn)象消失，效果與紅霉素表現(xiàn)一致。大鼠鼻部檢查可見，紫草素對(duì)鼻粘膜損傷的修復(fù)作用與劑量、用藥時(shí)間有關(guān)。中、高劑量在實(shí)驗(yàn)第7天鼻粘膜腫脹有改善，且沒有明顯的黏膜破損或潰瘍；第21天時(shí)，除低劑量(1mg/kg)組除1只大鼠鼻黏膜有炎癥反應(yīng)外，中、高劑量組大鼠鼻黏膜均恢復(fù)正常。

大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，紫草素對(duì)鼻損傷大鼠鼻黏膜上皮及固有膜的修復(fù)也與劑量、用藥時(shí)間相關(guān)。紫草素中、高劑量能明顯改善受損鼻黏膜，主要表現(xiàn)為黏膜柱狀上皮排列致密、整齊，固有膜充血、出血減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)得到改善。鼻黏膜炎癥區(qū)域中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著或極顯著低于模型對(duì)照組，也符合病理切片觀察結(jié)果。尤其在后期(第21天)，紫草素對(duì)損傷鼻黏膜的改善和修復(fù)作用更為明顯，幾乎達(dá)到抗生素(紅霉素)的效果。以上說明了紫草素對(duì)鼻黏膜機(jī)械性損傷修復(fù)有明顯改善作用，且與藥物劑量、用藥時(shí)間有關(guān)。

紫草素及其衍生物抗炎作用是通過抑制細(xì)胞ERK磷酸化，下調(diào)NF-κB活化，抑制iNOs蛋白表達(dá)發(fā)揮抗炎作用；也可通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NO分泌，促進(jìn)IL-10分泌；降低巨噬細(xì)胞中高遷移率族蛋白表達(dá)，或干擾NF-κB-P65的核轉(zhuǎn)移，抑制炎癥反應(yīng)；抑制IL-22介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌S100A7、S100A8等促炎因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)[8,14,16]。

紫草素能促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合，主要在于抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，和抑制瘢痕形成等方面發(fā)揮作用[17]。Chia Yen Hsiao等發(fā)現(xiàn)紫草素能使細(xì)胞增殖率達(dá)25%以上。蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紫草素處理后的成纖維細(xì)胞顯示出抗氧化活性、抗凋亡活性，它還能調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、使細(xì)胞分泌膠原蛋白、以及去除異常蛋白、促進(jìn)細(xì)胞增殖等。動(dòng)物模型也證實(shí)紫草素能加速SD大鼠側(cè)背創(chuàng)面的愈合[18-20]。梁鞏等用紫草素凝膠涂抹驢皮膚傷口，在實(shí)驗(yàn)第11天用藥組傷口收縮率、表皮上皮化顯著高于模型對(duì)照組，且皮膚組織排列整齊。他們還發(fā)現(xiàn)紫草素能使巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液TGF-β1、IL-10顯著升高，TNF-α和IL-6顯著下降，并且與用藥時(shí)間相關(guān)，這些結(jié)果說明紫草素能降低有關(guān)炎癥因子的表達(dá)，并促進(jìn)與細(xì)胞增殖、分化、傷口愈合等轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)傷口愈合[21]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，3種不同濃度的紫草素對(duì)損傷鼻黏膜修復(fù)均具有改善作用，可能與其抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。