羅瑪妮婭， 張 藝， 普 甜， 郭躋敏， 王 娟， 楊宇明， 鄭 元

(1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)綠色發(fā)展研究院， 云南 昆明 650233)

小葉龍竹(Dendrocalamusbarbatus)屬于禾本科、牡竹屬[1-3]，生長(zhǎng)海拔為360～1 100 m，是我國(guó)南部熱帶地區(qū)大型經(jīng)濟(jì)林竹種之一，一般用于建材、編織、食用、景觀用竹[4]。徐田等[4]對(duì)小葉龍竹造林方式、造林時(shí)間及幼林撫育管理方面進(jìn)行研究，為小葉龍竹栽培技術(shù)的發(fā)展提供技術(shù)指導(dǎo)。王娟等[5]對(duì)小葉龍竹外植體愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，建立了穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。楊楊等[6]針對(duì)小葉龍竹叢生芽的脫分化及愈傷組織過(guò)程進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)叢芽、莖尖長(zhǎng)出的愈傷組織效果最好，莖節(jié)次之。何巨擘等[7]篩選出最適合小葉龍竹根、芽快速繁殖與離體保存的MS培養(yǎng)基。楊清等[8]研究了小葉龍竹化學(xué)成分和制漿性能，纖維素含量高達(dá)51.00%，成漿容易，是一類優(yōu)質(zhì)的竹類纖維原料。黃美秀等[9]對(duì)小葉龍竹等12種竹子進(jìn)行種子萌發(fā)和品質(zhì)檢驗(yàn)探究。盡管前人已對(duì)小葉龍竹愈傷組織的誘導(dǎo)、快速繁殖與離體保存、植株的再生和遺傳特性、種子萌發(fā)等方面做了很多研究，但由于竹類植物種子材料難以獲得，針對(duì)小葉龍竹種子活力及繁育特性的研究少見報(bào)道。

種子的老化是在種子生理成熟后發(fā)生的，主要表現(xiàn)在外表形態(tài)、內(nèi)在結(jié)構(gòu)、生理變化等方面[10-12]。目前，國(guó)內(nèi)外種子貯藏研究中關(guān)于種子老化的研究報(bào)道較多。蔡春菊等[13]發(fā)現(xiàn)，毛竹種子在人工老化12 d時(shí)種子活力基本喪失，其生理指標(biāo)與種子活力呈極顯著正相關(guān)。徐敏等[14]進(jìn)行了棉花種子人工老化試驗(yàn)，隨著老化時(shí)間的增加，種子的電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量升高，其相關(guān)酶(POD、CTA、SOD)活性下降。王健宇等[15]研究了人工老化對(duì)柳枝稷種子活力和膜透性的影響，陳禪友等[16]對(duì)長(zhǎng)豇豆種子萌發(fā)進(jìn)程中生理生化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了相關(guān)研究，王仲等[17]對(duì)荷蘭豆種子人工老化過(guò)程中生理生化指標(biāo)的研究，劉月輝等[18]對(duì)辣椒種子老化過(guò)程進(jìn)行了生理生化分析。煙草(NicotianatabacumL.)[19]、水稻(OryzasativaL.)[20]、玉米(ZeamaysL.)[21-24]、小麥(TriticumaestivumL.)[25-26]、花生(ArachishypogaeaLinn.)[27]其他農(nóng)作物，白木香(AquilariasinensisL.)[28]、菊花(ChrysanthemumindicumL.)[29]等草藥也有報(bào)道，但關(guān)于小葉龍竹種子人工老化處理相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

為此，本研究以小葉龍竹新鮮種子為試驗(yàn)材料，通過(guò)設(shè)置高溫高濕的人工老化處理環(huán)境，比較分析其種子活力與生理生化特性隨老化天數(shù)的響應(yīng)趨勢(shì)，探索小葉龍竹種子在人工老化條件下的劣變規(guī)律，為小葉龍竹種子的貯藏及繁育研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2018年3月在云南省紅河州金平縣采收的小葉龍竹新鮮種子作為材料。

1.2 處理方法

將小葉龍竹種子置于人工氣候箱(寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，設(shè)置溫度40 ℃、相對(duì)濕度95%，進(jìn)行人工老化處理，連續(xù)處理19 d。分別在第1、4、7、10、13、16、19天進(jìn)行取樣，并測(cè)定不同老化天數(shù)小葉龍竹種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、含水量等生長(zhǎng)指標(biāo)，以及電解質(zhì)外滲率(REC)、游離脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性等生理生化指標(biāo)，以新鮮采收未經(jīng)老化處理的種子作為對(duì)照(ck)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

種子發(fā)芽試驗(yàn)采用《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》(GB 2772—1996)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率測(cè)定方法并進(jìn)行部分改進(jìn)[13]。用濾紙作為種子發(fā)芽床，不同老化處理天數(shù)均重復(fù)5次，每重復(fù)20粒。REC測(cè)定采用DDBJ-350型電導(dǎo)儀外滲電導(dǎo)法，Pro含量測(cè)定采用酸性茚三酮比色法，POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法[30]。不同老化處理天數(shù)的每個(gè)指標(biāo)均重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)凈重0.5 g種子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和制圖。使用SPASS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，并采用Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，不同字母表示在p≤0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對(duì)小葉龍竹種子發(fā)芽率的影響

種子的發(fā)芽能力是反映播種品質(zhì)的重要指標(biāo)，種子活力通常用發(fā)芽率(絕對(duì)發(fā)芽率)、發(fā)芽勢(shì)等指標(biāo)表示，隨著老化天數(shù)的增加獲得種子發(fā)芽率的變化情況(圖1)。

圖1 小葉龍竹種子在人工老化條件下的發(fā)芽率動(dòng)態(tài)變化

在經(jīng)過(guò)人工老化處理后，小葉龍竹種子發(fā)芽率隨老化天數(shù)的增加呈逐步下降的趨勢(shì)，ck發(fā)芽率為72%，人工老化處理第16天種子發(fā)芽率降至0，不同老化天數(shù)下的種子發(fā)芽率差異顯著(p<0.05)。在老化處理前7 d，種子發(fā)芽率緩慢下降，老化第10 天迅速下降，并在第10天以后一直處于較低水平，與ck相比發(fā)芽率顯著低了61%。在老化處理16 d以后，種子失去發(fā)芽能力。

2.2 人工老化對(duì)小葉龍竹種子發(fā)芽勢(shì)的影響

在經(jīng)過(guò)人工老化處理后，種子發(fā)芽勢(shì)隨老化天數(shù)的增加呈逐步下降的趨勢(shì)(圖2)，發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率變化趨勢(shì)一致，ck的發(fā)芽勢(shì)為39%，人工老化處理第16天發(fā)芽勢(shì)下降為0，差異顯著(p<0.05)；老化第7天迅速下降，其中老化第7、10、16天之間差異顯著(p<0.05)。

圖2 小葉龍竹種子在人工老化條件下的發(fā)芽勢(shì)動(dòng)態(tài)變化

2.3 人工老化對(duì)小葉龍竹種子含水量的影響

從圖3可以看出，在經(jīng)過(guò)人工老化處理后，種子含水量隨老化天數(shù)的增加呈下降趨勢(shì)，人工老化處理第19天含水量下降至3.72%，與ck(13.32%)差異顯著。小葉龍竹種子含水量與老化天數(shù)之間差異顯著(p<0.05)，在老化第1天、第4～10天、第13～16天、第19天之間差異顯著(p<0.05)。

圖3 小葉龍竹種子在人工老化條件下的含水量動(dòng)態(tài)變化

2.4 人工老化對(duì)小葉龍竹種子傷害度的影響

通過(guò)對(duì)種子進(jìn)行人工老化處理，隨著老化時(shí)間的增加，種子內(nèi)部功能受損、細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，電解質(zhì)出現(xiàn)外滲的現(xiàn)象，隨著老化天數(shù)的增加可以得到種子傷害度的變化情況(圖4)。

圖4 小葉龍竹種子在人工老化條件下的傷害度動(dòng)態(tài)變化

人工老化處理中，小葉龍竹種子的傷害度隨老化天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)。從人工老化第1天開始傷害度不斷上升，老化處理第10天略微下降后持續(xù)上升，人工老化處理第19天時(shí)傷害度達(dá)到最大峰值(46.79%)，與ck差異顯著，傷害度變化趨勢(shì)與種子發(fā)芽率的變化趨勢(shì)相反。ck、老化第1天、第4～19天的傷害度差異顯著(p<0.05)，第7～10天呈略微下降趨勢(shì)，傷害度差異不顯著(p>0.05)。

2.5 人工老化對(duì)小葉龍竹種子Pro含量的影響

在正常環(huán)境條件下，種子中Pro含量通常較低。在逆境條件下，Pro含量會(huì)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。通過(guò)人工老化處理，可以測(cè)定種子在逆境條件下隨老化天數(shù)的增加Pro含量的變化情況檢驗(yàn)種子的生理抗性(圖5)。

圖5 小葉龍竹種子在人工老化條件下Pro的含量動(dòng)態(tài)變化

人工老化處理中，小葉龍竹種子的Pro含量隨老化天數(shù)的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。人工老化第1～7天時(shí)Pro含量快速上升，第7天時(shí)Pro含量達(dá)到最大值(18.01 μg·g-1)，第19天達(dá)到最小值(1.42 μg·g-1)，形成一個(gè)單峰曲線，老化天數(shù)對(duì)種子的Pro含量差異顯著(p<0.05)。

2.6 人工老化對(duì)小葉龍竹種子SOD活性的影響

SOD的功能是催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，減少氧自由基對(duì)植物造成的傷害，確保植物細(xì)胞正常的生命活動(dòng)[31]。通過(guò)人工老化處理，測(cè)定種子隨老化天數(shù)的增加SOD活性的變化情況(圖6)。

圖6 小葉龍竹種子在人工老化條件下SOD活性的動(dòng)態(tài)變化

經(jīng)過(guò)人工老化處理后，小葉龍竹種子SOD活性呈先增加后下降的變化趨勢(shì)。人工老化處理第1～7天時(shí)SOD含量快速上升，第7天時(shí)SOD含量達(dá)到最大峰值(375.89 U·g-1)，隨后開始下降，第19天達(dá)到最小值(224.75 U·g-1)，形成一個(gè)單峰曲線。人工老化處理第7、10、13天小葉龍竹種子SOD活性間差異顯著(p<0.05)。

2.7 人工老化對(duì)小葉龍竹種子POD活性的影響

POD可進(jìn)一步清除由SOD催化反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2[31]。通過(guò)人工老化處理，測(cè)定種子隨老化天數(shù)的增加POD活性的變化情況(圖7)。

圖7 小葉龍竹種子在人工老化條件下POD活性的動(dòng)態(tài)變化

隨試驗(yàn)天數(shù)的增加人工老化處理的種子POD活性呈先增加后下降的趨勢(shì)。老化1～7 d時(shí)POD活性不斷上升，第7天時(shí)POD活性達(dá)到最大峰值[325.50U·(g·min)-1]，之后開始下降，第19天達(dá)到最低值，形成一個(gè)單峰曲線。老化處理小葉龍竹種子POD活性差異顯著(p<0.05)。老化第7、13、19天小葉龍竹種子POD活性間差異顯著(p<0.05)。

3 討 論

種子貯藏過(guò)程中發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率是反映種子活力的重要指標(biāo)[32]，蔡春菊等[13]、劉月輝等[18]、祝煜中等[22]、王玉嬌等[25]針對(duì)人工老化處理對(duì)種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)指標(biāo)的影響進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，種子隨著人工老化處理天數(shù)的增加，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，變化趨勢(shì)先快后慢，直至種子喪失基本活力。在人工老化過(guò)程中，老化天數(shù)增加，種子活力下降，這與小葉龍竹種子人工老化試驗(yàn)的研究結(jié)論一致。

電導(dǎo)率隨著老化天數(shù)的增加呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，種子在老化過(guò)程中電導(dǎo)率對(duì)種子膜脂過(guò)氧化的傷害加速種子老化，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，種子活力指數(shù)與種子電導(dǎo)率傷害度呈顯著負(fù)相關(guān)。小葉龍竹種子人工老化后電導(dǎo)率滲出量隨著老化天數(shù)的增加呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)，在老化第19天時(shí)達(dá)到最大峰值，在第10天有略微的下降，這可能與人工老化處理的小葉龍竹種子的生理特性和抗性有關(guān)。

通過(guò)人工老化處理，可以測(cè)定種子在逆境條件下隨老化天數(shù)的增加Pro含量的變化情況，檢驗(yàn)種子的生理抗性。SOD是一種普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的活性氧清除酶系統(tǒng)的保護(hù)酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生的歧化反應(yīng)，在維護(hù)細(xì)胞活性氧代謝的平衡中起重要作用[33]。POD也是植物中活性氧清除酶系統(tǒng)的一種保護(hù)酶，同時(shí)參與植物葉綠素的降解[34]、活性氧的產(chǎn)生，是植物衰老到一定階段傷害程度的反應(yīng)，可作為植物衰老的產(chǎn)物指標(biāo)[35-36]。在前人的大量研究中Pro含量、SOD活性、POD活性等生理生化指標(biāo)隨著電導(dǎo)率傷害度的增加而降低。本研究與前人研究結(jié)論相似，但是在人工老化第7天時(shí)，Pro含量、SOD活性和POD活性均達(dá)到一個(gè)最大峰值，隨后出現(xiàn)不斷下降趨勢(shì)。在人工老化處理時(shí)加大電導(dǎo)率傷害度，可以提高小葉龍竹種子Pro含量、SOD和POD的活性，但持續(xù)時(shí)間為7 d左右。由于老化天數(shù)的不斷增加，傷害程度不斷加深，種子自身內(nèi)在基質(zhì)已經(jīng)沒有能量物質(zhì)的存在，所以Pro含量、SOD活性和POD的活性開始逐步下降，證明小葉龍竹種子在人工老化處理?xiàng)l件下種子抗逆性持續(xù)時(shí)間為7 d左右。

本研究結(jié)果表明，小葉龍竹種子在人工老化條件下的SOD活性變化趨勢(shì)與POD活性變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明SOD酶在進(jìn)行催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)進(jìn)行自由基、H2O2的分解，需要POD的協(xié)助，清除SOD催化反應(yīng)產(chǎn)生、代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧、自由基等物質(zhì)，二者都是細(xì)胞的保護(hù)酶，其作用都是為了保護(hù)種子細(xì)胞的完整性。