詹國華 胡嘉欣 潘立鑫 王秋雁 向邦德

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型，占肝癌診斷和死亡的絕大多數(shù)［1］。長期以來，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染一直被認(rèn)為是HCC發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，其中全球超過一半的HCC病例均為HBV相關(guān)［2］。手術(shù)切除是HCC主要的治療手段，而目前相比傳統(tǒng)的手術(shù)切除，腫瘤的免疫療法也成為研究的熱點(diǎn)之一［3］。近年來，隨著研究的不斷深入，免疫療法在HCC的臨床應(yīng)用中顯示了巨大潛力［4］。腫瘤免疫微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，在疾病進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。既往已有研究報(bào)道了HBV相關(guān)性HCC的腫瘤免疫微環(huán)境特征，這為開發(fā)HBV相關(guān)性HCC的免疫療法提供了參考［5］。TP53是人類癌癥中最常發(fā)生改變的基因之一，大約50%的侵襲性腫瘤存在該突變［6］。在HCC中，TP53突變也是最常見的突變，且深刻影響著HCC的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。已有研究報(bào)道，TP53突變可導(dǎo)致HCC中的免疫反應(yīng)下調(diào)，從而影響HCC表型［7］。但關(guān)于TP53突變的HBV相關(guān)性HCC的免疫微環(huán)境特點(diǎn)鮮有報(bào)道。本研究使用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）描繪TP53突變的HBV相關(guān)性HCC的免疫圖譜，以期進(jìn)一步了解其免疫微環(huán)境特征，為HCC的免疫治療提出新見解。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集及隨訪

收集2018—2019年于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰脾外科接受肝切除術(shù)的38例患者的活體組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理均證實(shí)為HCC；以手術(shù)切除為初始治療；既往未接受放療、化療等抗腫瘤治療；無其他惡性腫瘤病史。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

本研究以門診和電話形式對38例患者進(jìn)行出院后隨訪，每隔6個(gè)月隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)及其時(shí)間，術(shù)后輔助性治療情況及治療方案，患者死亡時(shí)間及原因。隨訪截至2021年6月11日，其中死亡10例（TP53突變組8例，TP53未突變組2例），失訪3例?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術(shù)日至因HCC引起死亡或末次隨訪的時(shí)間。

1.2 主要儀器及試劑

細(xì)胞混旋儀、組織處理器購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，TD25?WS臺式低速離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀、DNA嵌入儀均購自Fluidigm公司。1.6%甲醛溶液購自Thermo Fisher公司，F(xiàn)c受體阻滯劑、鑭系金屬、MaxPar X8抗體標(biāo)記試劑盒、MaxPar PBS、Maxpar Cell Staining Buffer、順鉑、QTMFour Element Calibration Beads等均購自Fluidigm公司。

1.3 基因突變分析

本研究根據(jù)文獻(xiàn)查閱并確定常見的TP53突變位點(diǎn)，并主要關(guān)注熱點(diǎn)區(qū)域。首先，將提取的肝臟DNA標(biāo)本送至上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司測序，后續(xù)過程包括文庫構(gòu)建，數(shù)據(jù)質(zhì)控，序列比對，SNP calling，變異檢測及過濾，變異注釋等。其中，測序使用IlluminaX?10測序平臺，測序模式為Paired?end，測序讀長2×150 bp。變異篩選標(biāo)準(zhǔn)：⑴變異處測序總深度大于30；⑵變異在該處的總深度比例大于1%；⑶變異位點(diǎn)的質(zhì)量值Q=-10lgP＞10。對測序后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因突變信息統(tǒng)計(jì)，并將發(fā)生TP53特異位點(diǎn)突變的樣本定義為TP53突變組。

1.4 GyTOF標(biāo)志物的標(biāo)記與檢測

按照文獻(xiàn)［8］報(bào)道方法，解離組織，制備單細(xì)胞懸液，完成后將細(xì)胞懸液保存在液氮中。根據(jù)說明書，使用MaxPar X8抗體標(biāo)記試劑盒并將選定的抗體連接到同位素標(biāo)簽上。從每個(gè)樣本中提取100萬個(gè)活細(xì)胞，用MaxPar PBS配制順鉑（比例為1∶10 000），并將細(xì)胞染色，以確定細(xì)胞存活率。細(xì)胞懸液用人Fc受體阻斷劑室溫孵育10 min，再用表面抗體孵育1 h，然后洗滌。接著用核抗原染色緩沖液（25℃）孵育30 min，用細(xì)胞內(nèi)抗體孵育1 h，洗滌后在室溫下用1.6%多聚甲醛新鮮溶液孵育10 min，然后用DNA嵌入儀于4°C孵育過夜。上機(jī)檢測前，用10%的EQTM四元素校準(zhǔn)小球再懸浮細(xì)胞，然后用Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀以小于500個(gè)事件/秒的速率分析標(biāo)記樣本。CyTOF的實(shí)驗(yàn)操作流程見圖1。

圖1 質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作流程Fig.1 Experimental process of mass cytometry

1.5 CyTOF的數(shù)據(jù)分析

CyTOF應(yīng)用單細(xì)胞理論，使用金屬同位素標(biāo)記的抗體，允許在單個(gè)細(xì)胞中同時(shí)檢測多達(dá)40個(gè)參數(shù)。CyTOF克服了傳統(tǒng)流式通道之間發(fā)射光譜信號重疊的影響，能精確分析細(xì)胞亞群［9］。在Helios 2 CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析，檢測速度每秒小于500個(gè)細(xì)胞。本研究采集樣本數(shù)據(jù)后，統(tǒng)一使用CyTOF軟件v6.7對FCS數(shù)據(jù)文件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化合并處理。使用在線網(wǎng)站Cytobank（https://www.cytobank.org/）R 語言包（cytofkit、Rtsne、FlowSOM、cytofexplorer、ggplots等）分析FCS數(shù)據(jù)文件。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0和R 4.1.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。臨床基線資料之間的對比采用Fisher確切概率法；TP53突變組與TP53未突變組的OS比較采用R 4.1.0軟件中的survival包繪制生存曲線，采用Log?rank檢驗(yàn)評估兩組生存曲線的差異；TP53突變組（TP53未突變組）癌組織和癌旁組織的細(xì)胞亞群比例差異比較采用配對t檢驗(yàn)，TP53突變組與TP53未突變組癌組織細(xì)胞亞群比例差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用R 4.1.0中的heatmap包繪制熱圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，本研究共收集了38例HBV相關(guān)性HCC患者癌組織及其相對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，其中TP53突變?HBV相關(guān)性HCC（TP53突變組）19例，TP53未突變?HBV相關(guān)性HCC（TP53未突變組）19例，TP53突變組與TP53未突變組患者的年齡、性別等臨床基線資料分布，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義均（P＞0.05），見表1。

表1 TP53突變組和TP53未突變組患者的臨床基線資料Tab.1 Clinical baseline information of cases in the TP53 mutated group compared to the TP53 unmutated group

2.2 預(yù)后分析

生存分析結(jié)果顯示，TP53突變組與TP53未突變組的1年生存率分別為68.42%和93.75%，TP53突變組和TP53未突變組的生存曲線比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.24），見圖2。

圖2 TP53突變組和TP53未突變組的生存曲線Fig.2 Survival curves of TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.3 CyTOF鑒定細(xì)胞亞群

采用CyTOF鑒定TP53突變組和TP53未突變組的所有免疫細(xì)胞，結(jié)果鑒定為22個(gè)細(xì)胞亞群，其中包括3個(gè)CD4+T細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群1、8、14）、9個(gè)CD8+T細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群2、4、5、6、7、9、10、19、21）、1個(gè)B細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群20）、1個(gè)樹突（dendritic cells，DC）細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群3）、3個(gè)自然殺傷（natural killer cell，NK）細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群11、15、16）、2個(gè)NKT細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群12、13）、1個(gè)粒細(xì)胞亞群（細(xì)胞亞群22）和2個(gè)未知細(xì)胞群，見圖3～4。

圖3 TP53突變組和TP53未突變組的細(xì)胞亞群分布Fig.3 Distribution of cell subsets in TP53 mutated group and TP53 unmutated group

圖4 TP53突變組和TP53未突變組癌組織中免疫標(biāo)志物的表達(dá)情況Fig.4 Expreesion of immunomarker of tumor tissues between TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.4 TP53突變組和TP53未突變組的免疫微環(huán)境特征比較

對各組所含有細(xì)胞亞群的比例進(jìn)行比較，TP53突變組的各細(xì)胞亞群比例箱式圖和火山圖顯示，癌組織中CD4+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群1、14）比例較高（P＜0.05），而CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群10、19）、NK細(xì)胞（細(xì)胞亞群11）及NKT細(xì)胞（細(xì)胞亞群13）比例低于癌旁組（P＜0.05），見圖5。TP53未突變組也顯示，癌組織中CD4+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群1、14）比例較高（P＜0.05），而CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群7、9、10、19）、NK細(xì)胞（細(xì)胞亞群11）和NKT細(xì)胞（細(xì)胞亞群13）比例低于癌旁組（P＜0.05），見圖6。在TP53突變組和TP53未突變組癌組織各細(xì)胞簇比例箱式圖中，TP53突變組中CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群10）和CD4+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群8）的比例均較TP53未突變組高（2.26%vs0.47%，P=0.028；7.53%vs3.55%，P=0.046），見圖7。

圖5 TP53突變組癌組織和癌旁組織的各細(xì)胞群比例Fig.5 Proportion of cell population in tumor and paraneoplastic tissues of the TP53 mutated group

圖6 TP53未突變組癌組織和癌旁組織的各細(xì)胞群比例Fig.6 Proportion of cell population in tumor and paraneoplastic tissues of the TP53 unmutated group

圖7 TP53突變組和TP53未突變組癌組織的各細(xì)胞群比例Fig.7 Proportion of cell population in tumor tissues of the TP53 mutated group and TP53 unmutated group

2.5 TP53突變組和未突變組癌組織免疫細(xì)胞亞群的標(biāo)志物表達(dá)

基于對上述TP53突變組中CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞比例較高這一結(jié)果，進(jìn)一步分析突變組和未突變組癌組織中各免疫細(xì)胞亞群相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況。細(xì)胞亞群免疫標(biāo)志物的表達(dá)情況的熱圖顯示，突變組與未突變組癌組織差異表達(dá)的CD8+T細(xì)胞亞群表達(dá)活化細(xì)胞標(biāo)志分子CD45RA，細(xì)胞凋亡信號通路分子GranzymeB和激活分子HLA?DR，而CD4+T細(xì)胞亞群則表達(dá)CD45RO和HLA?DR，見圖8。

圖8 各細(xì)胞亞群免疫標(biāo)志物表達(dá)情況的熱圖Fig.8 Heatmap of immune marker expression by cell subtype

3 討論

既往多項(xiàng)研究對癌癥免疫治療反應(yīng)相關(guān)分子特征進(jìn)行鑒定，如腫瘤細(xì)胞中的腫瘤突變負(fù)荷、錯(cuò)配修復(fù)、新抗原等［10?11］。癌癥中抑癌基因蛋白 TP53突變經(jīng)常發(fā)生，且與癌癥不良預(yù)后相關(guān)［12］。有研究表明，TP53通過促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，在抑制腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用［13］，且與腫瘤免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［14?15］，如TP53激活可增強(qiáng)抗腫瘤免疫［16］。然而，當(dāng)TP53突變時(shí)，抗腫瘤效應(yīng)的喪失會導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常并促進(jìn)癌癥發(fā)生［17］。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)TP53突變與其治療耐藥性增加及預(yù)后較差有關(guān)［18］。TP53突變也是HCC中最常見的突變之一［19］，有研究發(fā)現(xiàn)TP53突變狀態(tài)與腫瘤微環(huán)境有關(guān)［20］。也有研究表明，TP53突變的免疫原性是由復(fù)雜的動力學(xué)驅(qū)動，可能包括人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）在腫瘤或抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）上的表達(dá)、T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的親和性、T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)運(yùn)等［21］。因此推測，TP53突變可能對HBV相關(guān)性HCC患者免疫微環(huán)境具有一定影響。CyTOF是利用質(zhì)譜原理對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)，可用于鑒定表達(dá)特定蛋白的細(xì)胞的大規(guī)模細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。這種技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平同時(shí)分析超過50種細(xì)胞參數(shù)，包括蛋白質(zhì)、核酸甚至小分子，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的精細(xì)分群，深入細(xì)胞內(nèi)部對信號通路、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期等進(jìn)行精細(xì)分析。目前，CyTOF已在腎癌［22］、乳腺癌［23］等多種實(shí)體瘤分析中發(fā)揮重要作用。為闡明TP53突變狀態(tài)下HBV相關(guān)性HCC的免疫微環(huán)境特征，本研究利用CyTOF對TP53突變組和TP53未突變組進(jìn)行免疫微環(huán)境研究。首先應(yīng)用CyTOF鑒定兩組的所有免疫細(xì)胞，結(jié)果將兩組的所有免疫細(xì)胞分為22個(gè)細(xì)胞亞群，從各細(xì)胞亞群比例箱式圖觀察到TP53突變組癌組織中CD4+T細(xì)胞比例較高，而癌旁組織中CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例較高。同樣地，在TP53未突變組也出現(xiàn)上述情況。但是在TP53突變組與TP53未突變組癌組織比較中，TP53突變組主要以CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞為主，TP53未突變組則以CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞NKT細(xì)胞為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，在TP53突變的乳腺浸潤性癌和肺癌中CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞和免疫溶細(xì)胞活性具有更高的富集水平［24］，與本研究結(jié)果一致。此外，有研究顯示，肝癌中的免疫細(xì)胞亞型也會影響患者預(yù)后［25］，但是遺憾的是，本研究中所鑒定的22個(gè)細(xì)胞亞群，并未發(fā)現(xiàn)與預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞亞群，考慮原因可能與本研究病例數(shù)較少、隨訪時(shí)間較短有關(guān)，這一方面值得深入探究。

根據(jù)腫瘤免疫編輯假說，腫瘤發(fā)展過程中，具有免疫原性的癌細(xì)胞較少，因此規(guī)避了抗腫瘤的免疫反應(yīng)［26］。而這也可能導(dǎo)致免疫抑制細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）增加，免疫反應(yīng)細(xì)胞（如T細(xì)胞濾泡性輔助細(xì)胞）減少［7］。例如，在TP53高危肺鱗狀細(xì)胞癌患者中單核細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞浸潤率普遍高于低?；颊撸呶；颊叩妮o助性CD8+T細(xì)胞和T細(xì)胞比例更低［27］。本研究觀察到TP53突變組中CD8+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群10）和CD4+T細(xì)胞（細(xì)胞亞群8）比例較高，根據(jù)各免疫標(biāo)志物表達(dá)情況得出該CD8+T細(xì)胞亞群表達(dá)活化細(xì)胞標(biāo)記分子CD45RA，以及參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號通路分子GranzymeB和激活分子HLA?DR，表明該細(xì)胞群為初始性CD8+T細(xì)胞；而CD4+T細(xì)胞亞群則表達(dá)CD45RO和HLA?DR，可能為記憶性CD4+T細(xì)胞。類似地，有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠突變的TP53肉瘤細(xì)胞生長過程中，也產(chǎn)生了針對新抗原的CD8+T和CD4+T細(xì)胞［28］。由此可見，當(dāng)TP53突變體被有效地處理和呈現(xiàn)免疫原性，可能產(chǎn)生癌癥特異性免疫反應(yīng)。綜上所述，在HBV相關(guān)性HCC中，相對TP53未突變的HBV相關(guān)性HCC，TP53突變下的HBV相關(guān)性HCC中主要富集初始性CD8+T細(xì)胞和記憶性CD4+T細(xì)胞，且與腫瘤微環(huán)境的免疫作用有關(guān)，具有免疫異質(zhì)性，但這2個(gè)細(xì)胞亞群中是否還存在其他產(chǎn)生影響的免疫分子，仍需進(jìn)一步研究。