李秀鋒,高 征,劉艷慧,徐 旭,梁國威

航天中心醫(yī)院檢驗科，北京 100049

載脂蛋白E(ApoE)是主要的膽固醇載體，作為低密度脂蛋白(LDL)受體的配體，參與脂質(zhì)代謝中受體介導的乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)殘粒的清除和膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運，在維持外周組織和大腦的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面起重要作用[1-2]。ApoE基因常見的2個單核苷酸多態(tài)性(rs429358和rs7412)產(chǎn)生3個不同的等位基因(ε2、ε3和ε4)和6個ApoE基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4 和ε4/ε4)[3]。有研究顯示，ε2純合子與Ⅲ型高脂蛋白血癥相關(guān)[4]，而ε4等位基因則與高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病發(fā)病風險增加有關(guān)[5-6]。血清小而密低密度脂蛋白膽固醇(sdLDL-C)已成為動脈粥樣硬化新的獨立危險因素[7-8]。但影響sdLDL-C生成的確切機制目前并不完全清楚。由于LDL是由VLDL轉(zhuǎn)化而來，而ApoE在VLDL清除方面起重要作用，ApoE基因變異是否與血清sdLDL-C水平變化具有顯著相關(guān)性，目前相關(guān)文獻鮮見報道。本研究在大樣本體檢人群中探討了ApoE基因型與血清sdLDL-C的相關(guān)性，以期明確ApoE基因是否是血清sdLDL-C水平變化的遺傳影響因素。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究對象為2018年12月至2019年12月于航天中心醫(yī)院行體檢的人群1 446例，平均年齡(47±11)歲，男830例，女616例。根據(jù)調(diào)查問卷和實驗室檢測指標，排除妊娠和伴有急、慢性感染性疾病、血液系統(tǒng)及惡性腫瘤等疾病的患者。本研究通過航天中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查(項目批號：201900301-YN-14)，研究對象均簽署知情同意書。收集研究對象年齡、性別、身高、體質(zhì)量等基礎資料，計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。

1.2方法 抽取研究對象清晨空腹靜脈血，以3 000 r/min離心5 min后取血清2 mL，使用日本奧林巴斯AU2700全自動生化分析儀及配套試劑，用于肝功能[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)]、腎功能[尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)]、血脂四項[三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]、sdLDL-C及空腹血糖的檢測，4 h內(nèi)檢測完畢。EDTA抗凝外周全血2 mL用于基因組DNA提取，提取后的基因組DNA-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1ApoE基因型檢測 使用天根生化科技(北京)有限公司的血液、細胞、組織基因組DNA提取試劑盒進行全血DNA提取。所提取的DNA用紫外分光光度計測定水平及純度，要求DNA的吸光度(A)260/A280在1.8～2.0 nm。使用武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司的人類ApoE基因檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，在美國ABI 7500實時熒光定量PCR儀上進行檢測。該試劑盒檢測ApoE2 526C>T、ApoE4 388T>C兩個位點的多態(tài)性。試劑盒最低檢出限可達到1 ng標本中能準確檢測出對應基因型。重復檢測對應基因型10次，應檢出對應基因型，且檢測結(jié)果Ct值變異系數(shù)(CV)≤5%。實驗結(jié)果由2名工作人員核對判讀，若2名工作人員對某標本判讀結(jié)果不一致，則復查該標本。

1.2.2血清sdLDL-C水平檢測 采用過氧化物酶法，在日本奧林巴斯AU 2700全自動生化分析儀上進行定量檢測。配套試劑及校準品由北京九強生物技術(shù)有限公司提供。分析靈敏度：標本水平為2.59 mmol/L(100.0 mg/dL)時，其A值變化在0.0 500～0.2 500。對高、低不同水平血清標本重復測定標本10次，CV≤10%。儀器定期校準，質(zhì)控測定值在標示值范圍內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1ApoE基因型和等位基因分布頻率 1 446例研究對象中共檢出6種ApoE等位基因型，ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3、ε2/ε4、ε3/ε4、ε4/ε4基因型所占比例分別為1.11%(16/1 446)、13.07%(189/1 446)、68.26%(987/1 446)、1.87%(27/1 446)、14.45%(209/1 446)、1.24%(18/1 446)。其中ε3等位基因占比最大，占82.02%(2 372/2 892)，ε2等位基因、ε4等位基因占比分別為8.58%(248/2 892)、9.41%(272/2 892)。ε2位點和ε4位點等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=2.584，P=0.108和χ2=3.240，P=0.072)，顯示標本來自一個穩(wěn)定的群體，具有群體代表性。

2.2ApoE基因型間血清sdLDL-C水平及臨床指標比較 從ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4至ε4/ε4，各基因型之間的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義，且呈升高趨勢(P<0.001)，其余各項指標的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；單純ε2位點突變與ε3/ε3基因型比較，ε2/ε2型和ε2/ε3型的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平降低(P<0.001)；單純ε4位點突變與ε3/ε3基因型比較，ε4/ε4型與ε3/ε4型的血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平升高(P<0.05)，ε3/ε4型的血清TC和LDL-C水平與ε3/ε3型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；對于ε2位點和ε4位點共同雜合變異型ε2/ε4型，其血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平低于ε3/ε3型(P<0.05)，見表1。

表1 血清sdLDL-C水平及臨床指標在不同ApoE基因型間的比較

2.3ApoE基因型對血清sdLDL-C水平的影響 根據(jù)ApoE基因型與血清sdLDL-C水平的對應關(guān)系，將ApoE基因ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4型依次賦值1、2、3、4、5、6的梯度性增加作為自變量，采用多元線性回歸分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分別為無任何變量控制；控制年齡和性別；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。分析顯示ApoE基因型對血清sdLDL-C水平的影響均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，見表2。

表2 ApoE基因型對血清sdLDL-C水平的影響

進一步針對ε2位點，將ε3/ε3、ε2/ε3、ε2/ε2型依次賦值1、2、3，進行多元線性回歸分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分別為無任何變量控制；控制年齡和性別；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。結(jié)果顯示，ApoE的ε2位點對血清sdLDL-C水平的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，單純ε2位點(ε2/ε2和ε2/ε3)突變的人群血清sdLDL-C水平降低，見表3。

表3 ApoE的ε2位點對血清sdLDL-C水平的影響

進一步針對ε4位點，將ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4型依次賦值1、2、3，進行多元線性回歸分析，模型1、模型2、模型3、模型4和模型5依次分別為無任何變量控制；控制年齡和性別；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C；控制年齡、性別、BMI、空腹血糖、TC、TG、HDL-C、LDL-C、UREA、UA、CREA、ALT、AST、GGT、ALP。結(jié)果顯示，ApoE的ε4位點對血清sdLDL-C水平的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，單純ε4位點(ε4/ε4與ε3/ε4)突變的人群血清sdLDL-C水平升高，見表4。

表4 ApoE的ε4位點對血清sdLDL-C水平的影響

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，在體檢人群ApoE的6種基因型中，與ε3/ε3型比較，ε2/ε2型和ε2/ε3型的sdLDL-C水平降低，ε4/ε4型和ε3/ε4型的sdLDL-C水平升高，ε2與ε4共同雜合變異型ε2/ε4型的sdLDL-C水平低于ε3/ε3型。多元線性回歸分析顯示，控制各種與血清sdLDL-C水平相關(guān)的指標后，ApoE的ε2、ε4位點對血清sdLDL-C水平的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ε2/ε2、ε2/ε3型血清sdLDL-C水平降低，ε4/ε4、ε3/ε4型血清sdLDL-C水平升高。

ApoE是人體血液中最主要的載脂蛋白成分之一,存在于CM、VLDL、中間密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)中[9-10]。受體代謝途徑是脂蛋白代謝最主要的途徑,由ε2、ε3和ε4編碼的3種ApoE異構(gòu)體具有不同的受體結(jié)合活性,必然影響血脂代謝速度,導致機體血脂水平的差異[10-11]。王克勤[12]研究認為，ApoE2與LDL受體的結(jié)合活性只有ApoE3的1%～2%,使CM和VLDL及其殘粒不能被肝臟攝取,血漿VLDL水平上升；同時由于VLDL轉(zhuǎn)變?yōu)長DL減少,導致肝細胞LDL受體表達上調(diào),細胞攝取LDL增加,使血漿中LDL-C水平進一步降低。相反地,ApoE4與LDL受體親和力高,使CM和VLDL殘粒代謝加速,肝細胞內(nèi)游離膽固醇增加,肝細胞表面LDL受體下調(diào),體內(nèi)LDL分解代謝減少,最終使LDL-C水平升高。本研究結(jié)果顯示，單純ε2位點(ε2/ε2和ε2/ε3)突變的人群血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平均降低；單純ε4位點(ε4/ε4與ε3/ε4)突變的人群血清sdLDL-C水平升高，ε4/ε4型血清TC和LDL-C水平也升高；ε2位點和ε4位點共同雜合變異型ε2/ε4型血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平低于ε3/ε3型，與上述研究的生理生化過程一致，并且ε2與LDL受體結(jié)合活性降低的作用大于ε4與LDL受體結(jié)合活性升高的作用，從而引起ε2/ε4型血清sdLDL-C、TC和LDL-C水平的降低。

血清sdLDL-C是LDL-C的亞型之一，影響sdLDL-C生成的確切機制目前并不完全清楚。LDL-C顆粒的形成涉及VLDL生成、VLDL-IDL-LDL級聯(lián)中的脂肪分解、各種脂蛋白(CM、VLDL、LDL和HDL)間的脂質(zhì)交換和載脂蛋白交換，以及脂代謝相關(guān)酶等多個環(huán)節(jié)[13]。而ApoE在VLDL清除方面起重要作用，但ApoE基因變異是否與血清sdLDL-C水平變化具有顯著相關(guān)性，目前相關(guān)文獻鮮見報道。NIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ApoE2人群血清sdLDL-C水平降低，與本研究結(jié)果一致，但未進行ApoE基因型與血清sdLDL-C水平的獨立相關(guān)性分析。SING等[15]研究認為，多達16%的LDL-C遺傳變異可能與ApoE基因位點的等位基因差異有關(guān)。本研究經(jīng)過多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，控制各種與血清sdLDL-C水平相關(guān)的指標后，ApoE的ε2、ε4位點對血清sdLDL-C水平的影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，ε2/ε2、ε2/ε3型血清sdLDL-C水平降低，ε4/ε4、ε3/ε4型血清sdLDL-C水平升高，說明ApoE基因是血清sdLDL-C水平變化的遺傳影響因素之一。

綜上所述，ApoE基因多態(tài)性與血脂代謝密切相關(guān)，是血清sdLDL-C水平變化的獨立遺傳影響因素。ε2等位基因可降低血清sdLDL-C水平，而ε4等位基因則可升高血清sdLDL-C水平。本研究的局限性是研究對象屬于自然人群，后續(xù)會進一步研究疾病人群中ApoE基因型分布特征及其與血清sdLDL-C的相關(guān)性。