王麗 耿生蓮 鄭長祿 永嘎拉毛

摘要 [目的]揭示19種高原灌木對低溫脅迫的生理響應和抗寒性差異。[方法]以栽植苗木的一年生枝條為材料，研究低溫處理（-5、-15和-25 ℃）對參試樹種相對電導率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量及脯氨酸含量的影響，并采用隸屬函數(shù)法對參試樹種的抗寒性進行了綜合評價。[結果]隨脅迫程度的加劇，參試樹種的相對電導率均呈逐漸升高趨勢;多數(shù)參試樹種的SOD和POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其活性在-15 ℃或-25 ℃脅迫條件下達到峰值;大部分樹種中脯氨酸含量隨脅迫程度加劇而增加，MDA含量則呈先增加后減少或逐步增加的趨勢。參試樹種的抗寒性強弱順序依次為水柏枝>甘蒙檉柳>黃刺玫>紫丁香>金葉榆>烏柳>四川丁香>紅刺玫>香莢蒾>山杏>香茶藨子>沙棘>連翹>牡丹>珍珠梅>紫葉李>紫葉矮櫻>榆葉梅>暴馬丁香。[結論]該研究可為篩選適宜高海拔地區(qū)城鎮(zhèn)園林栽培灌木樹種提供依據(jù)。

關鍵詞 低溫脅迫;灌木;生理指標;隸屬函數(shù);綜合評價

中圖分類號 S 718.3? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）21-0149-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.036

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Evaluation of Cold-resistance of 19 Plateau Shrubs

WANG Li?? GENG Sheng-lian?? ZHENG Chang-lu3，4 et al

（1. Qinghai Academy of Agriculture and Forestry，Xining， Qinghai 810016; 2. Qinghai Plateau Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Qinghai University， Xining， Qinghai 810016; 3. Qinghai Economic Research Institute， Xining， Qinghai 810008; 4. Qinghai Research Center of Ecological Civilization， Xining， Qinghai 810008）

Abstract [Objective]To reveal the physiological response and cold resistance of 19 plateau shrubs to low temperature stress. [Method]Taking annual branches of seedlings as materials， the effects of low temperature treatment （- 5 ℃， - 15 ℃ and - 25 ℃） on the relative conductivity， superoxide dismutase （SOD） activity， peroxidase （POD） activity， malondialdehyde （MDA） content and proline content of the tested tree species were studied， and the cold resistance of the tested tree species was comprehensively evaluated by membership function method. [Result]The results showed that the relative electric conductivity （REC） increased with the development of the stress levels. For most of the testing species， the activity of leaf superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） first increased with stress level， and peaked at stress treatment of -15 ℃ or -25 ℃. The content of proline in most tree species increased with the aggravation of stress， while the content of MDA increased first and then decreased or gradually increased. The content of MDA increased first and then decreased or gradually increased. The order of cold-resistance from high to low was as follows： Myricaria laxiflora>Tamarix austromongolica> Rosa xanthina>Syringa oblata>Ulmus pumila cv ‘Jinye>Salix cheilophila>Syringa sweginzowii>Rosa rugosa var. cathayensis>Viburnum farreri>Armeniaca sibirica>Ribes odoratum>Hippophae rhamnoides> Forsythia suspensa>Paeonia suffruticosa>Sorbaria sorbifolia>PrunusCerasifera>Prunus×cisterna>Amygdalustriloba>Syringa reticulate.[Conclusion]The study can provide a basis for screening shrub species suitable for urban garden cultivation in high altitude areas.

Key words Low-temperature stress;Shrub;Physiological index;Subordinate function;Comprehensive evaluation

基金項目

青海省科學技術廳科技攻關項目（2018-NK-A3-4）。

作者簡介 王麗（1985—），女，內蒙古商都人，工程師，在讀博士，從事植物抗逆生理研究。*通信作者，副研究員，從事城市林業(yè)、生態(tài)修復研究。

收稿日期 2021-03-31;修回日期 2021-07-22

綠化是改善城市生態(tài)環(huán)境的有效途徑，可有效吸收大氣污染物，調節(jié)局地氣候。但綠化樹種的選擇需考慮區(qū)域氣候條件，堅持“適地適樹”基本原則。青海省地處青藏高原東北部，平均海拔在3 500 m以上[1]，年均氣溫低，熱量條件不足。高原城鎮(zhèn)的綠化需選擇抗寒性較強的適生種，開展樹種的抗寒性評價對城市綠化樹種的選擇具有指導意義。

在冬季來臨之際，隨著氣溫的逐漸降低，植株體內會發(fā)生一系列適應低溫的生理生化變化[2]。冷脅迫導致的生理指標變化與膜透性的改變關系密切，膜損傷引發(fā)電解質外滲[3]，導致代謝紊亂。以相對電導率來指示質膜透性的大小，部分研究表明植物的抗寒性與質膜透性呈負相關[3-5]。除相對電導率外，部分其他生理指標也被證實與植物的冷脅迫響應有關，被廣泛用于抗寒性的綜合評價。黎繼嵐等[6]研究了低溫脅迫對高原水稻幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響，證實低溫脅迫可提高水稻SOD活性，對植物起到保護作用，提高抗寒能力。SOD活性隨著冷脅迫程度波動，零下冰凍時上升，溫度回升后下降。以梔子葉片為材料，自然降溫過程中，SOD、POX活性增強，丙二醛含量（MDA）含量下降等適應性變化是植物抗寒性適應和提高的基礎[7]。為評價江蘇省徐州市8種常綠闊葉樹的抗寒性，盧芳[8]通過觀察葉片結構，測定相對電導率、可溶性糖含量、MDA、SOD活性等生理指標，闡明了上述樹種的低溫適應生理變化，對其抗寒性的綜合評價基本真實地反映了它們的抗寒能力，評價方法可靠。

耿生蓮等[9]在三江源區(qū)通過實地調查，明確了三江源區(qū)城鎮(zhèn)園林種植的樹種組成。該研究以三江源區(qū)城鎮(zhèn)園林綠化種植的19種灌木樹種為研究對象，于2019年9月取一年生枝條進行人工模擬低溫處理，測定分析了抗寒相關生理指標的變化，綜合評價了19種灌木樹種的抗寒性。通過建立科學的抗寒評價體系，為篩選適宜高海拔地區(qū)城鎮(zhèn)園林栽培用灌木樹種提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試材料于2019年9月采集于三江源地區(qū)部分城鎮(zhèn)，具體采集地點見表

于2019年9—10月進行抗寒性研究試驗。采集一年生枝條，石蠟封口，塑料自封袋帶回實驗室后進行低溫脅迫處理和相關生理指標測定。處理前，將離體枝條先用自來水沖洗1遍，再用去離子水沖洗3遍，吸水紙吸干水分。冷脅迫處理設置-5、-15、-25? ℃ 3個溫度梯度，5 ℃為對照（CK），各溫度梯度下，每個樹種設置3個生物學重復。枝條裝入自封袋后置于低溫冰箱中進行人工模擬降溫處理，降溫速率5 ℃/h。達到設定溫度后，保持24 h，處理結束。將處理后的材料全部轉入5 ℃冰箱中暫存，進行相關生理指標測定。

1.2 電解質滲透率的測定

采用電導率法測定電解質的相對外滲率。將葉片取出后，避開葉脈和葉緣，剪成0.5 cm×1.0 cm的細條，準確稱取0.1 g裝入15 mL試管中，加入10 mL去離子水，充分振蕩后于室溫下靜置4 h，使用雷磁DDSJ-308F型電導率儀測定葉片浸提液電導率，記錄為R1。將試管煮沸30 min，流水冷卻至室溫后搖勻，再次測定電導率，記錄為R2。以相對電導率（REC）表示電解質的相對外滲率，即細胞膜透性的大小。相對電導率計算公式：相對電導率（REC）=R1/R2×100%。

1.3 其他生理指標的測定

1.3.1 MDA、SOD、POD活性的測定。

準確稱取0.5 g葉片并剪成小段，將材料轉移至研缽中，加入液氮快速研碎。向研磨后的組織中加入4.5 mL 0.1 mmol/L（pH 7.0）預冷的磷酸鹽緩沖液，研磨混合均勻。將勻漿液轉入離心管，4 ℃ 6 000 r/min離心10 min。取上清液進行后續(xù)測定，每組試驗3次重復。POD、SDO活性和MDA含量的測定和計算均使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行。

1.3.2 脯氨酸含量的測定。

稱取0.1 g葉片并剪成小段，液氮研磨后，加入9倍體積的勻漿介質（南京建成生物工程研究所研制試劑盒提供）。將勻漿液轉入離心管，4 ℃ 6 000 r/min離心10 min，取上清液使用試劑盒進行測定，每組試驗3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 抗寒性綜合評價。

采用隸屬函數(shù)法對各項指標進行綜合分析，評價樹種抗寒性[10]。與抗寒性正相關的脯氨酸含量、SOD活性、過氧化氫酶（CAT）活性和POD活性，其隸屬函數(shù)法計算公式如下：

Rij=Xij-XjminXjmax-Xjmin

與抗寒性負相關的電解質滲透率、MDA含量，其隸屬函數(shù)法計算公式如下：

Rij=1-Xij-XjminXjmax-Xjmin

式中，Xij為樹種指標的測定值;Xjmin為各樹種中j指標的最小值;Xjmax為各樹種中j指標的最大值;Rij為i樹種j性狀的隸屬值（0

1.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析。所有試驗數(shù)據(jù)采用SAS統(tǒng)計軟件進行顯著性分析，使用Origin 8軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對細胞膜透性的影響

圖1顯示，5 ℃條件下，參試19種灌木樹種葉片的相對電導率均保持在較低水平（10.7%～30.38%）。低溫處理顯著促進了葉片電解質釋放，增加了相對電導率。所有樹種葉片經(jīng)-25 ℃脅迫處理后，其相對電導率均顯著高于CK。在參試的19種灌木中，低溫脅迫對水柏枝和甘蒙檉柳葉片的相對電導率影響最小，說明上述2種灌木在冷脅迫條件下調控電解質外滲的能力較強。

2.2 低溫脅迫對葉片MDA含量的影響

圖2顯示，低溫脅迫顯著促進了MDA在參試樹種葉片中的積累，但不同樹種MDA含量的積累規(guī)律有所不同。在香莢蒾、珍珠梅、榆葉梅、紫葉李、紫葉矮櫻5個樹種中，MDA含量隨脅迫程度加劇而增加;沙棘、連翹和香茶藨子在-5 ℃低溫脅迫下MDA含量出現(xiàn)下降，之后MDA含量隨脅迫程度加劇而增加。顯示在一定溫度范圍內，上述樹種葉片MDA含量與脅迫程度間可能存在正相關關系。山杏、金葉榆、暴馬丁香、紅刺玫、紫丁香、烏柳、牡丹、水柏枝、四川丁香9個樹種中，-5 ℃或-15 ℃溫度處理可使MDA含量達到峰值?？傮w上看，低溫脅迫條件下，甘蒙檉柳在19個參試樹種中葉片MDA含量最低，且處理間差異不顯著。

2.3 低溫脅迫對葉片SOD活性的影響

從圖3可見，在香莢蒾、暴馬丁香、榆葉梅、紫丁香、沙棘、牡丹、甘蒙檉柳、連翹、水柏枝、四川丁香10個樹種中，-5、-15 ℃脅迫處理均使葉片SOD活性增強，并在-15 ℃條件下達到最高值。說明在一定溫度范圍內，葉片SOD活性可能與脅迫溫度正相關。在山杏、金葉榆、珍珠梅、黃刺玫、紅刺玫、紫葉李、紫葉矮櫻、香茶藨子8個樹種中，-5 ℃脅迫處理使葉片SOD受到抑制，此后隨著脅迫加劇，葉片SOD活性迅速增強，并于-15 ℃或-25 ℃處理條件下達到峰值。低溫脅迫對烏柳葉片SOD活性的影響與其他參試樹種不同，3種不同溫度脅迫條件下的活性均顯著低于CK。上述結果說明19種參試灌木葉片的SOD活性對冷脅迫存在明顯響應，但其響應規(guī)律在不同樹種間存在差異。

2.4 低溫脅迫對葉片POD活性的影響

由圖4可見，低溫脅迫對葉片POD活性的影響在參試的19個樹種中存在明顯差異。低溫處理顯著增強了香莢蒾、山杏、金葉榆、黃刺玫、沙棘、牡丹、水柏枝、四川丁香8個樹種葉片POD活性，表明POD參與了上述樹種對冷脅迫的適應。在珍珠梅、榆葉梅、紅刺玫、烏柳、甘蒙檉柳、連翹、香茶藨子、紫丁香8個參試樹種中，溫度脅迫對葉片POD活性無顯著影響。而在暴馬丁香、紫葉矮櫻、紫葉李3個樹種中，低溫脅迫對葉片POD活性表現(xiàn)出顯著的抑制效果。上述結果表明不同樹種POD對冷脅迫的響應存在差異。

2.5 低溫脅迫對葉片脯氨酸含量的影響 從圖5可見，低溫脅迫顯著促進了脯氨酸在山杏、金葉榆、暴馬丁香、珍珠梅、黃刺玫、紅刺玫、紫葉李、紫丁香、沙棘、牡丹、甘蒙檉柳、連翹、水柏枝、四川丁香、香茶藨子葉片中的積累，說明脯氨酸作為滲透調節(jié)物質可能參與了大部分參試樹種的低溫脅迫響應。在香莢蒾、榆葉梅、紫葉矮櫻3個樹種中，低溫脅迫雖然可使葉片脯氨酸含量增加，但與CK相比，增加幅度不顯著?？傮w上看，部分樹種如甘蒙檉柳、水柏枝等葉片脯氨酸含量相對較高，且對低溫脅迫響應敏感。而部分樹種如紫葉矮櫻、榆葉梅、連翹、四川丁香等葉片脯氨酸含量保持在較低水平，且對低溫脅迫的敏感性較低。

2.6 抗寒性綜合評價

采用單一指標評價植物的抗寒性具有片面性，難以準確反映植物耐受冷脅迫的整體表現(xiàn)。采用隸屬函數(shù)法，對多個耐寒相關指標進行綜合性評價可避免片面性。表2采用相對電導率、MDA含量、SOD活性、POD活性和脯氨酸含量5個指標，對參試的19個樹種的抗寒性進行了綜合性評價。結果表明，19個樹種的抗寒性為水柏枝>甘蒙檉柳>黃刺玫>紫丁香>金葉榆>烏柳>四川丁香>紅刺玫>香莢蒾>山杏>香茶藨子>沙棘>連翹>牡丹>珍珠梅>紫葉李>紫葉矮櫻>榆葉梅>暴馬丁香。

3 結論與討論

植物的抗逆性是與多種性狀密切相關的綜合性表現(xiàn)，因此對其評價也涉及形態(tài)結構、生理生化和基因表達等多個層級的指標[11]。相對電導率通過測定電解質滲漏引發(fā)的電導率變化來衡量脅迫引發(fā)的質膜受損程度，是應用廣泛的單一抗逆評價指標[12]。雖然現(xiàn)階段多采用綜合性指標體系評價植物抗逆性，但該指標仍是抗逆評價指標體系的重要組成部分，被廣泛應用于植物抗寒、抗鹽[13]、抗旱[14]等抗性評價。該研究中，低溫脅迫均顯著增加了19種參試樹種的相對電導率，但脅迫條件下甘蒙檉柳和水柏枝葉片的相對電導率保持在較低水平，暗示低溫脅迫對上述2個樹種細胞膜的損傷較輕，抗寒性較強。通過隸屬函數(shù)法進行綜合分析發(fā)現(xiàn)，水柏枝和甘蒙檉柳在19種參試樹種中的抗寒性最強，該結果與相對電導率的測定結果具有一致性，印證了相對電導率作為評價植物抗寒性指標的可靠性。

包括低溫在內的多種脅迫可誘導細胞內活性氧的產(chǎn)生與積累，造成細胞損傷[15]。因此，具有自由基清除作用的抗氧化酶活性被認為與植物抗寒性存在緊密關系。李清亞等[16]在對8個豆梨品種的抗寒性評價研究中發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫程度的加深，各品種的POD和SOD活性整體均呈先上升后下降的趨勢，這一結果與近期發(fā)表的關于杏[17]、蘋果[18]、牧草[19]、北美冬青[20]等植物中的活性變化規(guī)律一致。該研究中，隨著脅迫程度的加劇，大部分參試樹種的SOD和POD活性也呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律，說明大部分參試樹種中這2種抗氧化酶對冷脅迫的響應模式可能具有保守性。作為植物脅迫響應的關鍵酶，SOD和POD在植物的低溫脅迫響應中發(fā)揮著重要作用，一般認為這2種保護酶的活性與抗寒性正相關，因此這2項指標常被作為抗寒性綜合評價的參試指標。

指標體系和評價方法是量化分析的基礎，對準確評價植物抗寒性具有實踐指導意義。從已有報道來看，形態(tài)、生理、分子指標均可用于抗寒性評價[21]，而基于相對電導率、SOD活性、POD活性、MDA含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量等生理指標的評價研究最多，是應用最為廣泛的指標體系?？购詫俣嗷蚩刂频膹碗s性狀，因而其評價應采用與抗寒性直接相關的復合指標體系。基于隸屬函數(shù)的模糊數(shù)學方法是植物抗寒性評價中使用最為廣泛的方法，經(jīng)該方法綜合評價的抗寒性更能反映實際結果。綜合評價19種高原灌木后發(fā)現(xiàn)，參試樹種的抗寒性為水柏枝>甘蒙檉柳>黃刺玫>紫丁香>金葉榆>烏柳>四川丁香>紅刺玫>香莢蒾>山杏>香茶藨子>沙棘>連翹>牡丹>珍珠梅>紫葉李>紫葉矮櫻>榆葉梅>暴馬丁香。榆葉梅和暴馬丁香抗寒性最弱，紫丁香、金葉榆的抗寒性強于紫葉矮櫻，這與前人的研究結果一致[22-23]。該研究對上述19個樹種的抗寒性綜合評價可為高原耐寒適栽灌木的選擇提供借鑒與參考。

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