周麗亞 李小利 曹子肖 向俊馨 劉佳慧 李殿明

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 呼吸系病臨床基礎(chǔ)安徽省重點實驗室 233004

肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,據(jù)2020年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)GLOBOCAN分析報告顯示,全球肺癌新發(fā)例數(shù)達220.7萬；死亡例數(shù)達179.6萬[1]。其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全世界所有肺癌病例的絕大部分,分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌等[2]。近年來,NSCLC的治療盡管采用了多種手段,但5年生存率仍較低,其原因在于,NSCLC診斷時大多已處于中晚期,因而導(dǎo)致生存率低。因此,篩選新的生物標志物對NSCLC的早期診斷意義重大。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一組位于細胞核或胞質(zhì)內(nèi)且長度大于200 nt的RNA,是機體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物,不具有任何生理活性[3],但具有包括保護蛋白質(zhì)編碼基因在內(nèi)的多種生物學(xué)功能,從而影響著細胞增殖、分化、侵襲轉(zhuǎn)移、凋亡、細胞周期及基因組穩(wěn)定性[4]。

近年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,對包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤的早期診斷和治療中具有重要意義[5]。然而,這些lncRNA中絕大多數(shù)的功能尚未能確定。FEZ家族鋅指1反義RNA1(FEZ family zinc finger 1-antisense RNA 1,FEZF1-AS1)作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,已經(jīng)證實在各種腫瘤中上調(diào),參與腫瘤的進展,其潛在的應(yīng)用前景包括腫瘤的分子診斷、治療和預(yù)后評估等方面。本文就FEZF1-AS1在NSCLC發(fā)生中的作用研究進展作一綜述。

1 FEZF1-AS1概述

FEZF1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,從7號染色體的加鏈轉(zhuǎn)錄,定位于編碼FEZF1的同源基因的相反鏈上,位于7q31.32號染色體上,產(chǎn)生2 564 bp轉(zhuǎn)錄本,含有7個外顯子,其中有611個互補核苷酸存在于FEZ F1-AS1第一外顯子和FEZ F1第一外顯子之間[6]。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)包括FEZF1-AS1-1201(679 bp,1個外顯子),FEZF1-AS1-202(2 653 bp,3個外顯子),FEZF1-AS1-203(768 bp,1個外顯子)在內(nèi)的FEZF-AS1的3個剪接變異體[7],然而它們都不具備編碼蛋白質(zhì)的功能。FEZF1-AS1表達上調(diào)在多種類型的癌癥中可被發(fā)現(xiàn),但在腫瘤細胞中的位置有不同的看法,且與腫瘤的關(guān)系密切,參與其發(fā)生發(fā)展過程。

2 FEZF1-AS1在NSCLC中的表達

He等[8]檢測NSCLC組織和鄰近正常組織中FEZF1-AS1的表達水平是通過采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction,q RTPCR)方法,結(jié)果表明,NSCLC組織中FEZF1-AS1的表達較高,其表達水平與NSCLC患者分化程度、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。FEZF1-AS1在NSCLC細胞系(A549、SPC-A1、H1299和PC9細胞)中也顯示出其表達水平高于正常肺細胞16HBE,因此認為,FEZF1-AS1在肺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,可以作為NSCLC的癌基因。另外,Liu等[9]研究中指出,高水平的lncRNA FEZF1-AS1與肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAD)細胞的侵襲性表型和LAD患者的預(yù)后不良有關(guān)。LAD細胞系(SPCA-1,NCI-H1299,A549,NCI-H441和LTEP-a2)和正常肺上皮細胞(BEAS-2B),siRNAs轉(zhuǎn)染敲除FEZF1-AS1,應(yīng)用實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR,RT-PCR)測定了FEZF1-AS1在LAD組織和相應(yīng)正常組織中的表達水平,結(jié)果顯示FEZF1-AS1在LAD組織中過表達,且與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),但與年齡、性別、吸煙和TNM分期無明顯關(guān)聯(lián)。通過細胞學(xué)實驗進一步發(fā)現(xiàn)FEZF1-AS1水平與FEZF1水平呈正相關(guān),FEZF1-AS1負調(diào)控FEZF1的表達在LAD細胞中起癌基因的作用,且兩者之間的相互作用已被報道[10]。

在肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma,LSCC)的研究中[11],收集37例LSCC組織和鄰近的非腫瘤組織,應(yīng)用RT-PCR測定及Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示FEZF1-AS1的低表達預(yù)測了LSCC的不良預(yù)后。同時,采用Kaplan-Meier方法和log秩檢驗分析發(fā)現(xiàn)高水平的FEZ F1-AS1與預(yù)后不良有關(guān)。

研究顯示[12],血漿lncRNA FEZF1-AS1也可作為診斷NSCLC的潛在生物標志物。該研究中抽取126例NSCLC患者和62例健康對照者的血漿,采用qRT-PCR方法檢測兩組FEZF1-AS1表達水平,采用化學(xué)發(fā)光法檢測血漿神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specifific enolase,NSE)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和CYFRA21-1水平。結(jié)果表明,FEZF1-AS1在NSCLC患者中具有較高的表達,進一步比較了FEZF1-AS1對CYFRA21-1、NSE和CEA的診斷能力,并通過二元Logistic回歸計算FEZF1-AS1和NSE的聯(lián)合診斷能力,結(jié)果表明,與FEZF1-AS1或NSE單獨相比,FEZF1-AS1和NSE聯(lián)合診斷能力明顯提高,換言之,FEZF1-AS1和NSE的結(jié)合使診斷更具權(quán)威性及臨床意義。統(tǒng)計學(xué)分析其表達與臨床特征及風(fēng)險性之間的關(guān)系,結(jié)果顯示:與遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤大小和疾病狀態(tài)有關(guān)；高水平表達的FEZF1-AS1其NSCLC風(fēng)險性顯著增加,且存在顯著的濃度依賴性關(guān)系。

越來越多的研究表明[13]FEZF1-AS1過表達與NSCLC的分化程度、疾病分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外,Meta分析結(jié)果表明,FEZF1-AS1的失調(diào)已在許多癌癥中被報道,在腫瘤組織和細胞系中的表達增加與癌癥患者較短的總生存率和無病生存率顯著相關(guān),并與預(yù)后不良和晚期臨床病理參數(shù)有關(guān)[14]。因此,FEZF1-AS1在腫瘤的治療靶點中可能具有潛在的重要意義,并被認為在該疾病的形成過程中可能起促進作用。

3 FEZF1-AS1在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用

3.1 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換通路 研究[8]表明下調(diào)FEZF1-AS1可抑制NSCLC的細胞增殖、集落形成、細胞侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程,而通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路也可調(diào)節(jié)EMT過程。在A549和SPC-A1細胞系中,通過沉默細胞系中的FEZF1-AS1,發(fā)現(xiàn)Slug,twist和Vimentin表達水平明顯下調(diào),而鈣黏附蛋白E(E-cadherin)和ZO-1表達水平明顯上調(diào)；進一步的研究證實FEZF1-AS1可通過與EZH2相互作用抑制E-cadherin的表達,若敲除FEZF1-AS1或EZH2則增加了E-cadherin在A549和SPC-A1細胞中表達；通過染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)和RNA免 疫 沉 淀 實 驗(RNA immunoprecipitation,RIP)測定結(jié)果顯示,FEZF1-AS1在A549細胞和SPC-A1細胞中能與EZH2和LSD1結(jié)合。因此,我們認為FEZF1-AS1促進細胞EMT可通過抑制NSCLC中的E-cadherin來實現(xiàn)。

3.2 p57通路 p57是細胞周期素依賴性激酶的抑制劑,被認為是抑癌基因,在許多癌癥中失調(diào)。在對LAD的研究中,Jin等[15]評價了CDK抑制劑(p15,p16,p21,p27,p57)的表達,結(jié)果顯示,沉默F(xiàn)EZF1-AS1可顯著提高p57的水平,即FEZF1-AS1也可通過靶向p57在人LAD中起癌基因的作用。通過應(yīng)用RIP證實了FEZF1-AS1可以直接與LAD細胞中的EZH2結(jié)合,而p57也是NSCLC中EZH2的直接靶點[16],進一步的實驗表明沉默的FEZF1-AS1可以顯著增加p57的水平,而EZH2的敲除也明顯增加了p57在LAD細胞中的表達水平,提示FEZF1-AS1可能通過與EZH2的相互作用來調(diào)節(jié)p57。此外,CHIP檢測表明,FEZF1-AS1可以將EZH2招募到p57啟動子區(qū)域并抑制其轉(zhuǎn)錄,從而促進LAD的進展。

3.3 作為miRNA海綿 有研究顯示[17],許多miRNA結(jié)合位點存在于多種RNA轉(zhuǎn)錄本上,即不同的RNA轉(zhuǎn)錄本可以具有相同的miRNA結(jié)合位點,它們能夠競爭共享相同的miRNA,調(diào)節(jié)靶向的RNA,進行相互交流,從而充當(dāng)相互競爭的內(nèi)源性RNAs,進而影響疾病的各種過程,其中就包含lncRNAs,此為所謂的競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)假說。一方面,lncRNAs對miRNA海綿的作用在確定miRNA水平及其翻譯抑制的潛力方面顯然是至關(guān)重要的；另一方面,它大大增加了miRNA-RNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。FEZF1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,同樣具備這種作用。

Huang等[18]分析NSCLC中FEZF1-AS1與miR-34a的關(guān)系及其對NOTCH-1的影響。細胞培養(yǎng)人NSCLC細胞系(H1993)及選取177例NSCLC患者,進一步的細胞學(xué)實驗并結(jié)合RT-PCR測定FEZF1-AS1和NOTCH-1m RNA的表達水平,分析其數(shù)據(jù)表明,NOTCH-1 m RNA的表達水平在非腫瘤組織中明顯低于NSCLC組織,且FEZF1-AS1和NOTCH-1呈顯著正相關(guān),表明它們之間可能存在相互作用；細胞轉(zhuǎn)染實驗表明,H1993細胞中miR-34a、FEZF1-AS1和NOTCH-1的表達水平明顯上調(diào),此外,FEZF1-AS1和miR-34a的過度表達對彼此的表達并無顯著影響,相反,FEZF1-AS1的過度表達可使NOTCH-1的表達上調(diào),而miR-34a過度表達介導(dǎo)下調(diào)的NOTCH-1和FEZF1-AS1過度表達的減少效應(yīng)。因此FEZF1-AS1可作為miRNA海綿調(diào)節(jié)miR-34a上調(diào)NOTCH-1,從而對癌細胞的侵襲和遷移具有促進作用。Song等[19]細胞學(xué)培養(yǎng)出肺癌細胞系(H1299和H520),通過細胞轉(zhuǎn)染及miRNA模擬FEZF1 AS1、ITGA11和miR 516b 5p,此外,用RTqPCR及Westernblot分析證實,miR-516b-5p在H1299和H520細胞中過表達,而ITGA11的表達在miR-516b過表達后降低；敲除FEZF1-AS1基因后,ITGA11蛋白水平降低,進一步研究了兩者之間表達的相關(guān)性,結(jié)果顯示H1299和H520細胞中,FEZF1-AS1過 表 達在m RNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著上調(diào)ITGA11-1的表達,在miRNA過表達后,miR-516b-5p顯著下調(diào)FEZF1-AS1的表達。細胞學(xué)實驗提示miR-516b-5p和FEZF1-AS1可能共享一個結(jié)合位點,ITGA11受miR-516b-5p和FEZF1-AS1的調(diào)控。因此,FEZF1-AS1可作為ceRNA,調(diào)節(jié)NSCLC中miR-516b-5p及其靶基因ITGA11。

4 FEZF1-AS1參與EGFR-TKIs耐藥

對于EGFR突變陽性的患者在使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)后的8～12個月內(nèi)往往會失去臨床活性,即產(chǎn)生了繼發(fā)性耐藥。目前已將其耐藥的機制以及耐藥后的治療作為研究重點。關(guān)于EGFRTKIs耐藥的機制目前多承認以下幾種:(1)繼發(fā)性EGFR突變的發(fā)生；(2)激活旁路信號；(3)組織病理學(xué)轉(zhuǎn)變；(4)下游信號通路的激活。LncRNAs已被證實參與一系列細胞過程,并在不同細胞位置的表觀遺傳轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達,并通過多種機制參與調(diào)節(jié)癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥性。已有相關(guān)研究顯示lncRNAs可能對NSCLC的EGFR-TKIs耐藥的調(diào)控具有重要意義。

4.1 lncRNA-UCA1參與耐藥 Xu等[20]研究了NSCLC中l(wèi)ncRNA-UCA1在EGFR-TKIs耐藥中的機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在獲得性吉非替尼耐藥的NSCLC組織和細胞(PC-9/GR)中l(wèi)ncRNA-UCA1上調(diào),進一步研究顯示,患者的PFS與UCA1表達水平呈負相關(guān),過表達可能是預(yù)后不良的新指標或吉非替尼治療的進展標志；RIP及CHIP檢測證實UCA1與EZH2結(jié)合,CDKN1A是UCA1/EZH2調(diào)控基因的真正靶點。細胞學(xué)實驗也證明UCA1可能通過抑制細胞凋亡、G1-S檢查點、表觀沉默CDKN1A轉(zhuǎn)錄來驅(qū)動NSCLC中吉非替尼的耐藥性。此外,Chen等[21]利用生物信息學(xué)在線程序和熒光素酶報告試驗驗證了UCA1在NSCLC細胞中作為miR-143的分子海綿,兩者在吉非替尼耐藥細胞系中呈負性表達,FOSL2是miR-143的靶點,免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)結(jié)果表明,FOSL2在吉非替尼耐藥NSCLC患者組織中的表達顯著上調(diào)。即UCA1/miR-143通路有助于過度表達UCA1的吉非替尼耐藥細胞系中的吉非替尼耐藥,對NSCLC中TKI獲得性耐藥的治療具有潛在的治療價值。這與有關(guān)對LINC00460,HOST2在吉非替尼耐藥中的作用機制的研究相似,均可作為miRNA的分子海綿[22-23]。由此可得出,lncRNA可能會模仿miRNA的靶點,從而用海綿狀的miRNA來減弱它們對沉默下游基因的影響,借此在NSCLC耐藥機制中發(fā)揮重要作用。

Wang等[24]分析了HOTAIR與EGFR-TKIs相關(guān)的耐藥機制。研究中采用qRT-PCR檢測出HOTAIR在肺癌細胞系(PC9/R、H1975、H1299和A549)和耐吉非替尼患者中低表達,且患者的PFS明顯下降；細胞轉(zhuǎn)染及Western Blot實驗表明HOTAIR的過表達會誘導(dǎo)EGFRTKIs耐藥的細胞凋亡,降低了Vimentin和N-cadherin的表達,而增加了E-cadherin的表達,即HOTAIR促進吉非替尼的耐藥性可以通過激活EMT來實現(xiàn)。該研究提示HOTAIR可能是預(yù)測EGFR-TKIs耐藥的潛在指標。事實上,EMT過程涉及到控制細胞生存、增殖和穩(wěn)態(tài)的整個信號網(wǎng)絡(luò)的重組,以Vimentin的表達升高和E-cadherin的表達下降為特征,使腫瘤細胞依賴于新的分子途徑,并對靶向治療不敏感,從而被認為廣泛參與EGFR-TKIs的耐藥途徑。

4.2 LINC00665參與耐藥 Liu等[25]通過研究分析了LINC00665與EGFR-TKIs相關(guān)的耐藥機制。將20例晚期NSCLC患者活檢標本分為兩組:從未接受過吉非替尼(NG)治療組和耐受吉非替尼(GR)組,與NG組比較,LINC00665在GR組患者中的表達水平顯著增加,且細胞學(xué)實驗也表明其在吉非替尼耐藥細胞(PC9/GR)中的表達水平約為吉非替尼敏感細胞(PC9)中的5倍。細胞轉(zhuǎn)染及敲除實驗顯示,相比單獨使用吉非替尼治療,LINC00665敲除聯(lián)合吉非替尼后可減少細胞遷移,從而預(yù)測Si-LINC00665和吉非替尼聯(lián)合治療可能是克服NSCLC中獲得性吉非替尼耐藥性的有效策略。RIP試驗和Westernblot結(jié)果表明LINC00665能直接結(jié)合PC9/GR細胞中的EZH2從而調(diào)控PI3K/AKT通路,敲除LINC00665基因可導(dǎo)致EZH2和非活性PI3K/AKT通路的減少,即LINC00665可能是EGFR-TKI療效的預(yù)測指標。

而FEZF1-AS1已被證實是以上這些耐藥機制中的重要調(diào)節(jié)因子。但其在NSCLC EGFR-TKIs耐藥中的作用機制仍需進一步深入研究,為實現(xiàn)其臨床潛力提供新的理論基礎(chǔ)。

總之,lncRNA FEZF1-AS1可作為一種致癌因子,通過調(diào)節(jié)信號通路、競爭內(nèi)源性RNA等多種方式調(diào)節(jié)基因的表達及蛋白質(zhì)磷酸化等分子生物學(xué)過程,從而調(diào)控腫瘤的增殖、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為,其抑制劑可延緩腫瘤的發(fā)生,進而對調(diào)節(jié)腫瘤的進展具有重要影響。相關(guān)研究證實FEZF1-AS1可能通過多種機制參與調(diào)節(jié)EGFRTKIs耐藥,但仍需要進一步的結(jié)構(gòu)研究來探索FEZF1-AS1在NSCLC的侵襲和癌變中的作用,功能實驗來闡明其與NSCLC臨床預(yù)后不良、耐藥及診斷和治療的關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突