于晶晶，孟 穎，葉金海

唾液腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是一種臨床常見(jiàn)的唾液腺惡性腫瘤，每年報(bào)道的發(fā)病率為3.0/100萬(wàn)～4.5/100萬(wàn)例，約占頭頸部惡性腫瘤的1%，約占唾液腺腫瘤的10%。除了最常累及小唾液腺(minor salivary glands,MSGs)外，還可累及大唾液腺(包括腮腺、下頜下腺和舌下唾液腺)，少數(shù)甚至?xí)奂榜袈溝?、淚腺等頭頸部其他部位[1]。與其他惡性腫瘤相比，SACC往往生長(zhǎng)緩慢，具有高度嗜神經(jīng)特性，侵襲性強(qiáng)并易入侵血管，導(dǎo)致血行轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞如侵襲進(jìn)入神經(jīng)束膜，則單純手術(shù)并不能完全切除干凈。唾液腺樣囊性瘤遠(yuǎn)期預(yù)后不良，文獻(xiàn)報(bào)道后5年生存率為89.0%，10年生存率為67.0%，15年生存率為39.6%[2]。對(duì)其治療方法包括手術(shù)治療、放化療、生物治療等[3]。近年來(lái)，對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制和分子表型的研究取得了一些進(jìn)展[4]，細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)、增殖實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)等體外實(shí)驗(yàn)方法的運(yùn)用，使研究人員逐漸認(rèn)識(shí)到外泌體在實(shí)體腫瘤的增殖、遷移和侵襲中起重要作用，進(jìn)一步探究關(guān)于外泌體在腺樣囊性癌中的功能具有重要意義，可為腺樣囊性癌的發(fā)病機(jī)制研究開(kāi)拓新思路。本文就外泌體在SACC中的功能研究進(jìn)展作一綜述，從而為臨床治療SACC提供新的理論基礎(chǔ)。

1 外泌體(exosomes)

外泌體(exosomes)最初由Johnstone等于1985年從綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞上清液中分離而得[5]。外泌體的直徑在40～100 nm，這種囊泡廣泛分布在體液中[6-7]，可由多種類(lèi)型的細(xì)胞分泌并釋放到細(xì)胞外間隙。最初外泌體的特性未被揭露，后隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)這種雙層膜性囊泡由多種成分組成，包括蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)、各種代謝物、RNA和DNA等[8]。外泌體常用的純化和檢測(cè)方法包括超速離心技術(shù)、蔗糖密度梯度離心法、聚乙二醇(ployethyleneglycol，PEG)沉淀法、超濾分離法、免疫親和捕獲方法[9]。每項(xiàng)技術(shù)都具備各自明顯的優(yōu)缺點(diǎn)，故應(yīng)根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要選取適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行外泌體的分離。通過(guò)透射電鏡、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)以及納米粒子追蹤分析儀(nanoparticle tracking analysis, NTA)粒徑分析實(shí)驗(yàn)聯(lián)合證明用上述方法從體液和細(xì)胞上清中分離出來(lái)的物質(zhì)是外泌體。外泌體是細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，EV)的一種亞型[10]，經(jīng)核內(nèi)體途徑形成，是由早期核內(nèi)體的向內(nèi)出芽形成的。其通過(guò)胞吐作用分泌到胞外，作用于相應(yīng)的靶細(xì)胞并產(chǎn)生一系列生理和病理作用。外泌體參與基本的生理過(guò)程，如神經(jīng)元通信[11]、抗原遞呈[12]、免疫應(yīng)答[13]、器官發(fā)育[14]和生殖性能[15]。它們還參與了一些病理過(guò)程，包括癌癥進(jìn)展[16]、炎癥[17]、心血管疾病[18]等。同時(shí)外泌體可攜帶功能性分子作為關(guān)鍵致病蛋白，與阿爾茨海默病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[19]。

2 外泌體對(duì)腫瘤的調(diào)控

外泌體參與許多機(jī)體的生理和病理過(guò)程，其中外泌體在腫瘤進(jìn)展方面產(chǎn)生的作用受到廣泛關(guān)注。外泌體對(duì)腫瘤調(diào)控所起的作用是雙向的，即不同類(lèi)型的外泌體起到促進(jìn)或抑制腫瘤的作用：大多數(shù)免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)對(duì)相應(yīng)特定靶細(xì)胞的作用抑制腫瘤生長(zhǎng)；而腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體(TEXs)則通過(guò)不同的機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。外泌體與腫瘤的雙向關(guān)系中后者的研究受到相對(duì)多的關(guān)注，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診療及耐藥性中具有重要的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。外泌體參與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如骨腫瘤、B細(xì)胞惡性腫瘤、黑色素瘤、白血病、肺癌、唾液腺樣囊性癌、消化道腫瘤。此外，外泌體在一些非腫瘤疾病中的作用也受到越來(lái)越多的關(guān)注。尿液外泌體是一種腎臟疾病的新型生物學(xué)標(biāo)志，在一些非腫瘤性肝臟疾病中外泌體也扮演著重要的角色，可作為肝臟疾病診斷和預(yù)后的潛在標(biāo)志，也可作為載體在細(xì)胞間傳遞藥物和靶向基因。

3 外泌體參與腫瘤進(jìn)展

外泌體中富含的腫瘤相關(guān)蛋白、核酸(包括miRNAs、lncRNAs、circRNAs、mRNAs、DNA)以及糖蛋白、糖脂等糖復(fù)合物和脂質(zhì)，是腫瘤診斷的重要特異性標(biāo)志物。隨著外泌體分子生物學(xué)特性和相關(guān)結(jié)構(gòu)功能研究的深入，其在腫瘤患者的血液或者其他體液中開(kāi)展“液體活檢”，這一獨(dú)特功能也逐漸揭露并得到越來(lái)越多的認(rèn)可。外泌體在腫瘤微環(huán)境中起到改變腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境、參與血管形成、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移、影響免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。Jang等研究顯示，在小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞系中，其來(lái)源的外泌體具有促癌作用，腫瘤來(lái)源的外泌體具有影響巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和M2極化的作用，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20]。Grange等研究發(fā)現(xiàn)，外泌體促進(jìn)血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成，尤其是促進(jìn)CD105+腎細(xì)胞癌發(fā)生肺部的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)等作為重要的信號(hào)分子由外泌體運(yùn)輸、傳遞給腫瘤微環(huán)境中的受體細(xì)胞，改變其正常生理或者病理過(guò)程，從而發(fā)揮重要的作用[21]。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腫瘤來(lái)源的外泌體通過(guò)miR-25-3p靶向于Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(KLF2)和KLF4，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2、ZO-1、occludin和Claudin5的表達(dá)，增加血管通透性，促進(jìn)血管生成，同時(shí)也促進(jìn)了結(jié)直腸癌向肝和肺的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中OVCAR-3 EOC細(xì)胞螯合作用觸發(fā)的外泌體(chelation-induced exosomes，CI-exosome)由細(xì)胞外鈣離子的螯合作用誘發(fā)產(chǎn)生并釋放到細(xì)胞外間質(zhì)，不同來(lái)源和不同類(lèi)型的外泌體亞類(lèi)調(diào)控著腫瘤細(xì)胞各異的生物學(xué)行為[23]。

4 外泌體在唾液腺樣囊性癌中的作用

外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)腫瘤作用的調(diào)控是雙向的。一方面，以自然殺傷(NK)細(xì)胞為代表的大多數(shù)免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)激活或殺傷靶細(xì)胞的能力對(duì)轉(zhuǎn)移性或血液病惡性腫瘤顯示出快速的免疫力，并且臨床上表現(xiàn)出一定的抗腫瘤能力[24]。另一方面，腫瘤來(lái)源的外泌體通過(guò)miRNA與腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展、血管生成、轉(zhuǎn)移和免疫逃逸[25]。這里著重于SACC細(xì)胞衍生的外泌體(TEXs)在SACC中作用的研究進(jìn)展，探索SACC來(lái)源外泌體在疾病進(jìn)展中的作用機(jī)制，并在一定程度上提示其潛在應(yīng)用于臨床腫瘤治療的意義。

4.1 促進(jìn)腫瘤增殖

正常細(xì)胞增殖與凋亡的平衡維持著體內(nèi)組織器官的生長(zhǎng)代謝平衡，而腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞增殖與凋亡的失衡主要表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞毫無(wú)約束地增長(zhǎng)以及凋亡作用的減弱，最終導(dǎo)致腫瘤快速發(fā)展。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可促進(jìn)唾液腺腺樣囊性癌的增殖。Liu等研究表明，通過(guò)PKH67綠色熒光標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)SACC-83可以攝取自身來(lái)源的外泌體，這表明SACC-83為自身來(lái)源外泌體的靶細(xì)胞，也意味著腺樣囊性癌細(xì)胞可通過(guò)外泌體途徑將促瘤因子傳遞給自身，改變自身基因表型，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能[26]；此外，MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證明了SACC-83來(lái)源的外泌體作用于SACC-83本身后其增殖能力顯著增強(qiáng)，這提示了在SACC腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，自身來(lái)源的外泌體扮演著“促瘤因子”的作用，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用是通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，NDRG2(N-myc downstream-regulated gene 2)基因的下調(diào)與較低的SACC總體生存率和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的生存率有一定的關(guān)系；外泌體攜帶的miRNA與SACC腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移也有關(guān)聯(lián)，這提示miRNA可能作為NDRG2基因的重要調(diào)控因子在SACC腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮不可忽視的作用[27]。馬杰等研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶阻斷劑genistein(4′-5,7-三羥基異黃酮)對(duì)SACC-83細(xì)胞株具有顯著的抑制效應(yīng)，且該抑制效應(yīng)具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，隨著劑量和時(shí)間的增加而增加[28]，其機(jī)制可能為genistein阻斷了細(xì)胞周期G2期向M期的轉(zhuǎn)變，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這為利用外泌體裝載genistein途徑治療SACC腫瘤細(xì)胞提供了新思路。

4.2 促進(jìn)腫瘤嗜神經(jīng)侵襲(PNI)

嗜神經(jīng)侵襲(perineural invasion，PNI)特性是SACC顯著的生物學(xué)特征之一，并且被認(rèn)為是不利的預(yù)后因素。Amit等調(diào)查了1985年至2011年間在全球9個(gè)癌癥中心接受過(guò)ACC治療的所有患者，在239例(48%)神經(jīng)侵犯患者中，有174例(73%)發(fā)生神經(jīng)周侵犯，65例(27%)發(fā)生神經(jīng)內(nèi)侵犯，37例(15%)發(fā)生神經(jīng)周?chē)装Y(癌細(xì)胞浸潤(rùn)到神經(jīng)周?chē)g隙中，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn))[29]。郭佳等研究發(fā)現(xiàn)，施萬(wàn)細(xì)胞作為神經(jīng)周?chē)[瘤微環(huán)境的一個(gè)關(guān)鍵因素，能通過(guò)NT-3/TrkC信號(hào)通路影響腫瘤微環(huán)境的變化，對(duì)SACC嗜神經(jīng)侵襲(PNI)起到促進(jìn)作用[30]，在NT-3的作用下，SACC細(xì)胞的TrkC特異性受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，激活下游Ras、Erk1/2、Ark和Bcl信號(hào)通路，提高SACC的侵襲能力。這一過(guò)程中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的可溶性小分子蛋白NT-3作為外泌體可能攜帶的物質(zhì)促進(jìn)腫瘤的嗜神經(jīng)侵襲，且腫瘤和神經(jīng)周?chē)奈h(huán)境有助于施萬(wàn)細(xì)胞早期主動(dòng)向腫瘤細(xì)胞的遷移[31-32]。最近對(duì)ACC中神經(jīng)周侵襲的存在進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)表明，它與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或生存率無(wú)關(guān)，但與局部復(fù)發(fā)和切緣累及有關(guān)[33]，這一特征影響患者的治療及預(yù)后。對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，隨訪過(guò)程中監(jiān)測(cè)腫瘤的臨床表現(xiàn)，對(duì)于更好地了解ACC并進(jìn)行進(jìn)一步臨床病理評(píng)估，以及改善預(yù)后至關(guān)重要。

4.3 促血管生成作用

血管生成對(duì)于實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[34]，SACC也不例外。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是極為重要的血管生成介質(zhì)因子[35-36]。血管生成的關(guān)鍵是促血管生成細(xì)胞因子的VEGF家族與其各自受體的相互作用，其中VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)，VEGF受體家族包含VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3。其中VEGFR2的表達(dá)通常僅限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，被廣泛認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)血管生成的主要受體[37]。劉佳等研究發(fā)現(xiàn)，一些基因和蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的水平來(lái)調(diào)節(jié)SACC的侵襲和轉(zhuǎn)移[38]，這些基因包括抑癌基因P53、PTEN、融合基因MYB-NFIB；蛋白包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha, HIF-1α)、癌胚抗原相關(guān)粘附因子-1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1, CEACAM-1)、整合素連接激酶(integrin-linked kinase, ILK)、黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)、DNA結(jié)合分化抑制蛋白(inhibitor of DNA-1, Id-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、STAT3(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、CD147(EMMPRIN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)。這些蛋白因子和基因之間也存在相互作用，共同調(diào)節(jié)VEGF水平。

4.4 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

SACC患者腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移頻繁發(fā)生，主要發(fā)生在治療后的前5年。研究表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率為20%～52%，平均時(shí)間31.50～46.00個(gè)月[39]。而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因。Syn等研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間或腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞間通信且關(guān)鍵的信使，細(xì)胞間借助外泌體來(lái)構(gòu)建局部和遠(yuǎn)距離的微環(huán)境[40]。腫瘤來(lái)源的外泌體(TDE)可能通過(guò)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、形成轉(zhuǎn)移前腫瘤微生態(tài)以及通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)腫瘤逃脫免疫監(jiān)測(cè)等機(jī)制，以促進(jìn)腫瘤增殖和擴(kuò)散而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的開(kāi)始。鑒于TDE在SACC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的重要作用，針對(duì)TDE的策略對(duì)于改善癌癥患者的結(jié)局至關(guān)重要。一些使用基于RNA的敲除策略提供了TDE抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的概念，可以設(shè)想利用外泌體的組織特異性將這類(lèi)治療性核酸藥物輸送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)治療的臨床應(yīng)用[41]。Ni等研究發(fā)現(xiàn)，SACC的血源性轉(zhuǎn)移與NRP1和VEGF-A的高表達(dá)以及Sema-3A和Sema-3F的低表達(dá)有關(guān)[42]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，由于NRP1和VEGF-A結(jié)合而引起的腫瘤組織中微血管數(shù)量增加，是導(dǎo)致SACC中血源性轉(zhuǎn)移常見(jiàn)的原因之一。

SACC腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)于肺，其次是骨骼、肝和腦，一些患者會(huì)涉及多個(gè)部位的腫瘤轉(zhuǎn)移[43]，由于其早期癥狀不明顯，因此在初次就診時(shí)容易遺漏血源性轉(zhuǎn)移病灶存在的可能。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，與SACC-2(低肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)和SACC-83(低肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)細(xì)胞相比，SACC-M(高肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞系)細(xì)胞中大多數(shù)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)的表達(dá)均降低，但磷脂酰肌醇蛋白聚糖5(Glypican-5,GPC5)表達(dá)在SACC-M中分別提高了3.24倍和815.69倍(超過(guò)3倍)[44]，HSPG和GPC5可由囊泡包裹至外泌體分泌到細(xì)胞外間質(zhì)。免疫組織化學(xué)分析顯示，與無(wú)肺轉(zhuǎn)移的SACC相比，有肺轉(zhuǎn)移的SACC中GPC5的表達(dá)更高。 盡管GPC5沉默對(duì)SACC-M細(xì)胞增殖沒(méi)有顯著影響，但GPC5沉默后，裸鼠SACC-M細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移明顯減少(P<0.05)。這些均提示GPC5可能有助于SACC的肺轉(zhuǎn)移。Kong等[45]研究發(fā)現(xiàn)，癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞(CAF)分泌的EVs在小鼠中誘導(dǎo)了肺轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成，因此增加了SACC肺轉(zhuǎn)移。由CAF分泌的EV促進(jìn)的肺成纖維細(xì)胞活化是肺轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成的關(guān)鍵事件。整聯(lián)蛋白α2β1介導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞攝取CAF分泌的EV，并被TCI-15阻斷，從而阻止了肺轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成和隨后轉(zhuǎn)移的發(fā)生。攜帶異種移植物并具有高肺轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的小鼠血漿EV整合素β1明顯上調(diào)。這表明血漿EV整合素β1可能是早期預(yù)測(cè)SACC轉(zhuǎn)移發(fā)生的有前途的生物標(biāo)志物。

ACC患者長(zhǎng)期生存率低與發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，針對(duì)腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞的綜合策略對(duì)于預(yù)防SACC轉(zhuǎn)移是必要的。針對(duì)HSPG、GPC5、CAF EV、血漿EV整合素β1等這些腫瘤來(lái)源外泌體的監(jiān)測(cè)有望成為進(jìn)行早期SACC診斷方面可能是有前途的有效候選靶標(biāo)。

5 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，外泌體與SACC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)是明確的。外泌體在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，尤其是在SACC的疾病進(jìn)展中，外泌體促進(jìn)了腫瘤的增殖、嗜神經(jīng)侵襲、促血管生成作用以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移。但是，目前大規(guī)模使用外泌體作為治療工具面臨著實(shí)際的挑戰(zhàn)。因?yàn)閹孜⒖说耐饷隗w就需要數(shù)十億個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的培養(yǎng)，目前還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的、有效的方法進(jìn)行外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)和純化；而且外泌體的治療劑量和治療效果有待進(jìn)一步研究，仍需要大量基于支持科學(xué)和轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)的臨床試驗(yàn)以便推動(dòng)外泌體治療的進(jìn)展。