胡福泉

陸軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物學(xué)教研室（重慶 400038）

噬菌體（bacteriophage）是寄生在細(xì)菌體內(nèi)的病毒。它們?cè)诩?xì)菌細(xì)胞中完成復(fù)制后可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞的裂解，因此被命名為“噬菌體”，即它們可以“吃細(xì)菌”的意思。這一名稱極大地吸引了人們?cè)跉v史上對(duì)于噬菌體長(zhǎng)久不衰的研究與關(guān)注。本文在此簡(jiǎn)述噬菌體的發(fā)現(xiàn)、噬菌體研究在推動(dòng)科學(xué)進(jìn)步上的歷史貢獻(xiàn)、噬菌體在疾病治療中的應(yīng)用、噬菌體在疾病診斷中以及其他領(lǐng)域中的應(yīng)用。

1 噬菌體的發(fā)現(xiàn)

噬菌體是地球上最富多樣性的生命體，它們存在于我們生活周圍的土壤、水體、空氣、海洋、飲用水、食品等環(huán)境中[1]。可以說，只要有細(xì)菌的地方，就會(huì)有噬菌體存在[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，地球生物圈中的噬菌體數(shù)量可達(dá)1030～1032個(gè)。噬菌體對(duì)于維持地球生物圈中的微生菌群及其生態(tài)系統(tǒng)的平衡有著極為重要的作用，因此對(duì)人類的生存及其健康有著極為重要的意義，是值得我們高度關(guān)注和深入研究的生命現(xiàn)象。

人們公認(rèn)噬菌體是由Frederick Twort和Félix d’Hérelle 分別在1915 和1917 發(fā)現(xiàn)的[3]。在噬菌體被人類發(fā)現(xiàn)前已有種種跡象表明噬菌體的存在。19世紀(jì)末，恒河流域爆發(fā)了罕見的霍亂流行。但這次流行并沒有迅速蔓延，而是很快自動(dòng)消失了。當(dāng)時(shí)，研究這次疫情的英國細(xì)菌學(xué)專家Ernest H.Hankin 發(fā)現(xiàn)：城市上游水體中霍亂菌為10 萬個(gè)/毫升，下游則僅為90個(gè)毫升。因此他推測(cè)恒河水中可能存在著可以將霍亂病菌殺滅的物質(zhì)。1896年Hankin報(bào)道印度的贊木納河及恒河的水中存在對(duì)霍亂病菌具有殺菌活性的物質(zhì)；這種活性具有可濾過性，且可被煮沸所破壞，但當(dāng)時(shí)他推測(cè)可能是一種化學(xué)物質(zhì)。Emmerich等（1901）報(bào)道有些細(xì)菌培養(yǎng)物在存放期間可以發(fā)生自溶解，用這種自溶解物可治愈同種細(xì)菌引起的實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物。但這時(shí)人們還沒有明確意識(shí)到“噬菌體”這種東西的存在。

Frederick Twort 于1915 年在國際著名雜志柳葉刀上發(fā)表了一篇文章，他當(dāng)時(shí)試圖在無活細(xì)胞的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)牛痘苗病毒。在一次偶然的試驗(yàn)中，他發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的污染菌落發(fā)生了“透明化變”（glassy transformation）。他將透明變菌落取一小點(diǎn)接種到其他菌落上，后者也發(fā)生了透明化轉(zhuǎn)變。他用吉姆薩染色透明化變的菌落，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌變成了一些更小的顆粒。Twort 在討論中做推論：很可能存在一種比細(xì)菌更小的且在超顯微鏡下看不到的“小病毒”（small virus），它們?cè)诩?xì)菌胞中生長(zhǎng)，形成一種具有“生長(zhǎng)力”（power of growth）的“不定形體”（no definite individuals），它們可引起細(xì)菌的急性傳染病。今天看來，Twort當(dāng)時(shí)所看到“透明變”區(qū)域，正是我們今天所說的“噬斑”。他指出導(dǎo)致菌落透明化變的因子具有生長(zhǎng)力，并使用了“virus”一詞，已經(jīng)接近噬菌體的本質(zhì)。

同一時(shí)期，F(xiàn)elix d’Herelle正在進(jìn)行另一項(xiàng)獨(dú)立研究。當(dāng)時(shí)，D’Herelle 被征召去研究法國軍隊(duì)中爆發(fā)的痢疾。他取痢疾病人的大便進(jìn)行過濾，以尋找那種可以在痢疾桿菌體內(nèi)生長(zhǎng)的“看不見的病毒”（invisible virus）。他驚奇地發(fā)現(xiàn)，這種不可見病毒可引起細(xì)菌培養(yǎng)物溶解，可使菌落變成透明區(qū)。他指出：這種不可見因子可以繁殖，細(xì)菌溶解是這種病毒繁殖的結(jié)果。總結(jié)自己的研究，D’Herelle于1917報(bào)道：發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)細(xì)菌具有拮抗性的微生物（a microbe antagonisitic to bacteria）；他把菌落透明變區(qū)首次稱之為“噬斑”（plaques）；把引起噬斑的東西稱為“超微病毒”（ultraviruses）；認(rèn)為它們可入侵細(xì)菌，在細(xì)菌體內(nèi)繁殖并“消費(fèi)”（expense）細(xì)菌；他第一次把這些超微病毒稱之為噬菌體（bacteriophage）；他提出噬菌體可作為傳染病的治療因子。

然而，D’Herelle有關(guān)噬菌體的觀點(diǎn)，一經(jīng)提出，就挑戰(zhàn)了細(xì)菌學(xué)家Jules Bordet 的觀點(diǎn)。Jules Bordet在1919剛獲得諾貝爾獎(jiǎng)，他的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了血清成分抗體及補(bǔ)體的溶菌作用。于是Bordet 及其同事立即著手研究噬菌體及其溶菌作用。Bordet 認(rèn)為所謂“噬菌體”不過是一種溶解酶而不是微粒性超顯微的微生物。Bordet 發(fā)動(dòng)了對(duì)D’Herelle 關(guān)于噬菌體觀點(diǎn)的攻擊。他立即用Twort 的文章挑戰(zhàn)D’Herelle 發(fā)現(xiàn)噬菌體的優(yōu)先權(quán)。D’Herelle 則回應(yīng)稱：Twort 觀察到的現(xiàn)象與他自己所研究的噬菌體溶菌現(xiàn)象是有本質(zhì)不同的。而Bordet的挑戰(zhàn)反而激發(fā)了D’Herelle進(jìn)行了一系列有關(guān)噬菌體本質(zhì)的研究。這種激烈爭(zhēng)議延續(xù)了十年之久。而Twort 則是被動(dòng)的卷入了這場(chǎng)戰(zhàn)爭(zhēng)，他扮演的是這場(chǎng)“Twort-D’Herelle”爭(zhēng)議戰(zhàn)中Bordet 的替身。1932 年，D’Herelle 和André Gratia（Bordet 的代表）同意進(jìn)行一場(chǎng)科學(xué)決斗：在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室，由高度受人尊敬的獨(dú)立科學(xué)家作為雙方的代表：他們是Paul-Christian Flu（萊頓熱帶醫(yī)學(xué)研究所所長(zhǎng)）和E.Renaux（Liege 大學(xué)的微生物學(xué)教授），由他們對(duì)Twort 的物質(zhì)和D’Herelle 的物質(zhì)，進(jìn)行“平行比較”（side-by-side comparison）。最后，他們得到的結(jié)論是：Twort 現(xiàn)象和D’Herelle 現(xiàn)象是相同的。因此，在這之后，人們公認(rèn)Twort 和D’Herelle 是噬菌體共同發(fā)現(xiàn)人。在噬菌體發(fā)現(xiàn)近100 年之際（2015年9月），Nature Reviews Microbiology發(fā)表了長(zhǎng)篇綜述性文章以紀(jì)念Twort和D’Herelle在發(fā)現(xiàn)噬菌體中的歷史貢獻(xiàn)[4]。

2 噬菌體研究在推動(dòng)科學(xué)進(jìn)步上的歷史貢獻(xiàn)

噬菌體一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，人們就期待它在抗細(xì)菌感染中發(fā)揮重大作用。然歷史來到了1928年，亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)了青霉素。當(dāng)時(shí)青霉素堪稱抗感染的萬能藥，能將大部分細(xì)菌感染疾病治好。隨后一大批其他類抗生素也相繼被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。由于抗生素在抗細(xì)菌感染中的有效性、廣譜性和廉價(jià)性，人們找到了抗感染的金鑰匙。在隨后的幾十年中，噬菌體用于抗感染治療的研究和應(yīng)用沒有再受到人們的重視。

然而無心插柳柳成蔭，噬菌體研究卻在生命科學(xué)領(lǐng)域結(jié)出了碩果。由于噬菌體個(gè)體微小，容易培養(yǎng)，且易于遺傳操作。因此，噬菌體成為人們研究生命現(xiàn)象的理想對(duì)象和材料[5]?？茖W(xué)家們利用噬菌體作為研究對(duì)象，以探索生命現(xiàn)象的許多規(guī)律，并取得了巨大成功[6]。美國冷泉港被奉為分子生物學(xué)的“圣地”，其實(shí)冷泉港學(xué)習(xí)班的頭兩期就是有關(guān)噬菌體的學(xué)習(xí)班，隨后才轉(zhuǎn)為分子生物學(xué)學(xué)習(xí)班。后來該學(xué)習(xí)班的講義衍化成為了“分子克隆”（molecular cloning）一書,現(xiàn)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的“圣經(jīng)”。可以說人類在生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)所取得的許多偉大成果、以及奠定今天分子生物學(xué)基礎(chǔ)的許多重要理論和技術(shù)都與噬菌體研究密切相關(guān)。這些重要成就包括：

Luria and Delbrück 1943 年利用噬菌體完成“彷徨試驗(yàn)”（fluctuation test），揭示了細(xì)菌的突變是發(fā)生在噬菌體選擇之前，噬菌體作為選擇因素不過是把突變子選擇出來而已?；诖怂麄兲岢隽恕巴蛔兣c選擇理論”。

Hershey and Chase 等1952 年通過用放射性元素P32標(biāo)記噬菌體DNA、用S35標(biāo)記噬菌體衣殼蛋白。在噬菌體繁殖的子代中發(fā)現(xiàn)了P32，并沒有發(fā)現(xiàn)S35的存在，從而證實(shí)了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA,這一工作獲得了1969年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1955 年Seymour Benzer 通過對(duì)T4 噬菌體rII基因精細(xì)結(jié)構(gòu)的解讀，揭示了生物遺傳學(xué)中“三聯(lián)密碼子”。

1961 年，F(xiàn)ran?ois Jacob and Jacques Monod 報(bào)道了大腸桿菌的乳糖酶調(diào)控系統(tǒng)，指出乳糖酶受底物誘導(dǎo)表達(dá)，且乳糖酶的表達(dá)受到DNA-結(jié)合蛋白（抑制子）、激活子以及終止子的調(diào)控，這些工作充分利用了基于噬菌體的載體，以λ噬菌體為范例，揭示了基因表達(dá)調(diào)控的通路。為此，Jacob,Monod and Andrè Lwoff獲得1965諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

1960s 晚期及1970s 初期，Wende 等發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的限制性修飾（restriction–modification，R-M）系統(tǒng)。DNA 修飾（常常是甲基化修飾）是為了保護(hù)大腸桿菌自身的DNA 免受限制性內(nèi)切酶的切割。后來Smith等發(fā)現(xiàn)II-型限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的序列特異性以及Weiss 等人發(fā)現(xiàn)了T4 噬菌體鏈接酶，這些工作直接為分子克隆技術(shù)的誕生奠定了必備基礎(chǔ)。為此，Werner Arber,Daniel Nathans and Hamilton Smith獲得1978年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

噬菌體載體為基因克隆提供了解決方案。λ噬菌體載體是強(qiáng)大的表達(dá)載體，Collins等利用λ噬菌體構(gòu)建了粘粒（Cosmid）,這使得大片段DNA 克隆成為可能?；赑1噬菌體構(gòu)建的人工染色體（artificial chromosomes），被用于克隆更大的DNA 片段?；贛13噬菌體載體的構(gòu)建、T7 噬菌體DNA 聚合酶的發(fā)現(xiàn)，為今天DNA高保真測(cè)序提供了解決方案。

噬菌體技術(shù)使得通過細(xì)菌基因的突變來研究基因功能成為可能。例如，λ自殺載體（在宿主菌中不能自主復(fù)制）可用于遞送轉(zhuǎn)座子，用于隨機(jī)致突變研究。利用M13 及fd 噬菌體可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）研究。又如Mu 噬菌體在大腸桿菌中可隨機(jī)轉(zhuǎn)座，用于制備轉(zhuǎn)座子文庫。它們都是研究基因功能的強(qiáng)有力工具。

噬菌體在基因組測(cè)序技術(shù)的建立與發(fā)展中舉足輕重，生物的全基因組測(cè)序首先就是在噬菌體中實(shí)現(xiàn)的。第一個(gè)被測(cè)序清楚的生物是由Walter Fiers 等于1976 年完成的ssRNA 噬菌體MS2。緊接著，1977年Fred Sanger 團(tuán)隊(duì)完成了ssDNA 噬菌體ΦX174 的基因組測(cè)序。1982年該團(tuán)隊(duì)又完成了dsDNA噬菌體λ的全基因組測(cè)序。在λ噬菌體測(cè)序中建立了鳥槍法文庫，使用的限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、M13噬菌體載體，全都是噬菌體產(chǎn)物。所建立的這些測(cè)序方法與流程后來被用于大腸桿菌及人類基因以及其他許多生物基因組的測(cè)序。

噬菌體展示（phage display）技術(shù)被譽(yù)為生物工程技術(shù)領(lǐng)域的奇葩。Smith 等利用噬菌體展示將編碼某種生物活性肽或蛋白的基因替換噬菌體的衣殼蛋白基因，從而把具有應(yīng)用價(jià)值的目標(biāo)基因表達(dá)在噬菌體顆粒表面，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模制備具有商業(yè)價(jià)值的生物活性肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

最近，炙手可熱的CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)是源于人們對(duì)噬菌體與細(xì)菌相互作用的深刻理解而建立起來的一種先進(jìn)技術(shù)[17-18]。這種技術(shù)利用了細(xì)菌對(duì)噬菌體的免疫機(jī)制，采用任意人工合成的“引導(dǎo)RNA”（guiding RNA）序列與Cas9 蛋白形成的復(fù)合物。在“引導(dǎo)RNA”的指引下，Cas9 可在基因組序列上的任一位置實(shí)現(xiàn)人工切割與編輯。

噬菌體也催生了現(xiàn)代合成生物學(xué)（synthetic biology）技術(shù)。2003 年，Venter 等通過人工合成并組裝了噬菌體ΦX174 基因組，這是首個(gè)通過合成生物學(xué)技術(shù)合成的生物基因組。合成生物學(xué)旨在通過人工合成一些具有某種性質(zhì)（或功能）的“基因元件”，再把所需的元件組裝在“底盤”（chassis）上，從而讓微生物表達(dá)與生產(chǎn)成人們所需要的產(chǎn)品。

噬菌體整合酶、重組酶被常被用于催化兩個(gè)序列的“位點(diǎn)特異性重組”（site-specific recombination）。基于噬菌體P1 的Cre–loxP 位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)已在真核細(xì)胞或細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)了精細(xì)的遺傳操作。

而T7 噬菌體RNA 聚合酶已被用于合成生物學(xué)中的“回路設(shè)計(jì)”（circuit design）。因此，將噬菌體用于電池、存儲(chǔ)器，生物計(jì)算機(jī)（biocomputor）等已不再是科幻小說中的事。

基于上述事實(shí)，可以毫不夸張地說，沒有噬菌體的研究及其相關(guān)知識(shí)積累，就不會(huì)有今天的分子生物學(xué)技術(shù)、基因工程技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)及基因編輯技術(shù)。

3 噬菌體在疾病治療中的應(yīng)用

噬菌體治療（phagotherapy）是指利用噬菌體來治療細(xì)菌引起的感染[9-11]。D’Herelle在研究法國軍隊(duì)士兵中爆發(fā)的痢疾時(shí)，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)期痢疾病人之糞便中的噬菌體滴度最高，他認(rèn)為病人的恢復(fù)與噬菌體的作用有關(guān)。在1919 年夏天，他又使用噬菌體來預(yù)防雞感染禽傷寒桿菌，并于1921年首次報(bào)告了用噬菌體來控制禽傷寒的流行。同年，Bruynoghe and Maisin報(bào)告使用葡萄球菌噬菌體來治療皮膚癤子。此外噬菌體還被用來治療死亡率很高的多殺巴斯德菌（pasteurella multocida）引起的牛出血性敗血癥。D’Herelle 于1920 s 想將噬菌體治療延伸到人體治療。在進(jìn)行人體治療之前，他口服了痢疾桿菌噬菌體懸液，在自己身上做安全性試驗(yàn)；在沒有任何局部和全身反應(yīng)情況下，他又給合作伙伴和他的家人注射了噬菌體懸液。在證實(shí)了噬菌體確實(shí)無害之后，他用痢疾桿菌噬菌體治療了痢疾病人（1926）。

引起最廣泛注意的是后來D’Herelle 使用直接淋巴結(jié)注射噬菌體治愈了4 例腹股溝淋巴結(jié)腺鼠疫（bubonic plague）。這一結(jié)果1925 年報(bào)道在法國雜志《La presse médical》上。之后，英國政府邀請(qǐng)D’Herelle到印度孟買研究使用噬菌體治療霍亂流行。來自印度1920 s and 1930 s的報(bào)告顯示，口服噬菌體治療使得霍亂病人癥狀的嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、以及死亡率明顯降低。1924年，巴西Oswaldo Cruz 研究所生產(chǎn)了抗痢疾噬菌體制劑，用于治療痢疾患者。1926 年，George Eliava和D’Herelle在前蘇聯(lián)格魯吉亞第比利斯建立了噬菌體研究所（Eliava Tbilisi Institute of Bacteriophage）。后來在1970 s，有幾個(gè)WHO 資助的在巴基斯坦進(jìn)行的研究顯示，高劑量的噬菌體治療與四環(huán)素治療有同等效果。這一時(shí)期，一些公司也開始在市場(chǎng)上銷售噬菌體制劑。其中，第比利斯噬菌體研究所一直堅(jiān)持噬菌體治療的研究與應(yīng)用，是現(xiàn)今國際上歷史最長(zhǎng)和規(guī)模最大的噬菌體治療研究機(jī)構(gòu)。1940 s年代，美國的Eli Lilly公司也曾生產(chǎn)了7種人用噬菌體制劑，用于治療葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等細(xì)菌感染。后來，由于抗生素的出現(xiàn)，噬菌體治療被西方國家所忽略。這段期間，噬菌體治療的研究主要存在于前蘇聯(lián)有關(guān)國家，如波蘭、格魯吉亞、俄羅斯等國境內(nèi)。

在我國，新中國建立之初，抗生素非常匱乏。我國也開始了噬菌體治療的研究和實(shí)踐。大連生物制品研究所、武漢生物制品研究所都在我國開展過噬菌體制劑的生產(chǎn)與應(yīng)用。1958 年，勞動(dòng)模范邱財(cái)康在大煉鋼鐵期間不幸嚴(yán)重?zé)齻?，感染了綠膿桿菌，在生命垂危之際，我國微生物學(xué)界老前輩余賀江氵教授率領(lǐng)的醫(yī)療小組利用噬菌體成功地?fù)尵攘饲褙?cái)康的生命。當(dāng)時(shí)人民日?qǐng)?bào)報(bào)道了此事，這一事跡也被拍成電影《春滿人間》。

當(dāng)前，噬菌體治療再度受到人們的關(guān)注。主要原因是隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，耐藥性細(xì)菌不斷出現(xiàn)且廣泛流行，甚至出現(xiàn)了多耐藥、泛耐藥菌株及超級(jí)細(xì)菌（superbug）。超級(jí)細(xì)菌感染變得無藥可用，細(xì)菌的耐藥性已構(gòu)成對(duì)人類的嚴(yán)重威脅。人類在抗生素之外，迫切需要尋求更多的抗感染手段。在此背景下，人類再次把目光投向了噬菌體治療。2013 年全球第一個(gè)噬菌體裂解酶產(chǎn)品Gladskin 上市，用于治療MRSA感染。目前還有多個(gè)噬菌體裂解酶已進(jìn)入臨床研究階段。2013 年美國FDA 批準(zhǔn)Intralytix公司研發(fā)的沙門氏菌噬菌體制劑SalmoFresh?為公認(rèn)安全產(chǎn)品，并批準(zhǔn)其上市。2014 年，美國NIH認(rèn)可噬菌體可作為抗耐藥的手段之一。2014 年，歐盟斥資520萬歐元啟動(dòng)噬菌體治療細(xì)菌感染的跨國臨床研究計(jì)劃Phagoburn。2014年，法國、比利時(shí)和荷蘭的科學(xué)家使用噬菌體治療大腸桿菌和綠膿桿菌的燒傷患者。2017年美國圣地亞哥全球衛(wèi)生研究所的專家Steffanie Strathdee 利用噬菌體成功救治了其丈夫的超級(jí)細(xì)菌感染。目前，我國上海市公共衛(wèi)生中心噬菌體研究所朱同玉領(lǐng)導(dǎo)的小組在利用噬菌體治療耐藥性細(xì)菌如鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷佰菌等引起的難治性感染取得成功，在我國開啟了噬菌體治療的新征程。

如果對(duì)噬菌體治療加以分析，我們不難看出其具有幾方面的優(yōu)越性：首先，噬菌體對(duì)細(xì)菌的侵染具有高度特異性，不會(huì)殺滅目標(biāo)菌種之外的細(xì)菌，這就避免了噬菌體的使用不會(huì)導(dǎo)致“菌群失調(diào)”一類醫(yī)源性疾病的發(fā)生；第二，噬菌體在體內(nèi)清除目標(biāo)菌后，會(huì)由于失去宿主菌，不能再復(fù)制，因而會(huì)從病人體內(nèi)消失，不會(huì)發(fā)生蓄積中毒；第三，噬菌體只感染細(xì)菌，不進(jìn)入人體細(xì)胞，不會(huì)擾亂人體細(xì)胞代謝，迄今尚未發(fā)現(xiàn)噬菌體治療帶來毒副反應(yīng)；第四，噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制后，其遺傳物質(zhì)與宿主菌基因組間可發(fā)生重組，成為細(xì)菌多樣性的驅(qū)動(dòng)力；第五，由于噬菌體感染不進(jìn)入人體細(xì)胞，目前尚未發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)人體具有致突變能力與遺傳毒性。

概括自噬菌體治療的百年歷史，人們用噬菌體治療過的病原體包括葡萄球菌、鏈球菌、克雷伯氏菌、大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌和沙門氏菌、鮑曼不動(dòng)桿菌等[12]。在人體治療過的疾病包括外傷感染、手術(shù)后感染、燒傷感染、胃腸炎、膿毒血癥、骨髓炎、皮膚感染、泌尿道感染、膿胸和肺炎等等。最引人注目的是：對(duì)于那些由超級(jí)細(xì)菌感染的病人，已到無藥可用的地步，噬菌體治療是目前唯一的選擇。

噬菌體治療已有百年歷史，但尚未得到廣泛地應(yīng)用，必然有其限制性瓶頸：

①噬菌體對(duì)宿主菌的識(shí)別特異性太高[13-14]。一般而言，一個(gè)噬菌體在同一“菌種”的菌株中，只能感染少數(shù)菌株，其敏感性覆蓋率通常在百分之幾至百分之十幾。故通常認(rèn)為：噬菌體對(duì)細(xì)菌識(shí)別特異性是在細(xì)菌“株”水平。很難找到一種噬菌體對(duì)某種細(xì)菌的感染普遍有效，這種狀況嚴(yán)重限制了噬菌體制劑的廣泛應(yīng)用。

②噬菌體本是大分子蛋白和核酸的復(fù)合體，具有很強(qiáng)的免疫性，可激活機(jī)體對(duì)噬菌體制劑的免疫清除機(jī)制。因此，反復(fù)在同一個(gè)體使用噬菌體治制劑，會(huì)導(dǎo)致噬菌體制劑在體內(nèi)的生物半衰期大為縮短，降低治療效果。

③反復(fù)在同一個(gè)體使用同一噬菌體制劑，有可能引發(fā)過敏反應(yīng)。

④噬菌體制劑被廣泛應(yīng)用后，必然像抗生素那樣，細(xì)菌會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生耐受性[15]。

根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生耐受的幾率似乎比抗生素耐受幾率更高。也就是說，在推廣噬菌體治療之后，細(xì)菌對(duì)噬菌體的耐受亦然會(huì)是一個(gè)嚴(yán)峻的問題。

4 噬菌體在疾病診斷中的應(yīng)用

4.1 用于細(xì)菌的鑒定與分型

細(xì)菌鑒定與分型的傳統(tǒng)技術(shù)是基于細(xì)菌的表型特征，如形態(tài)、染色、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等表觀特征。傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定與分型技術(shù)定義的一個(gè)細(xì)菌的“種”，利用噬菌體則可將其進(jìn)一步分為若干“噬菌體型”。如利用噬菌體可將具有Vi 抗原的的傷寒沙門氏菌分為96 個(gè)噬菌體型。需要指出的是，由于噬菌體宿主譜的多樣性，噬菌體在細(xì)菌鑒定中主要由于“種”之下的進(jìn)一步分型[16]。噬菌體分型目前在臨床病原學(xué)診斷中意義不大，但在病原體的流行病學(xué)溯源方面具有重要意義。

4.2 用于檢測(cè)標(biāo)本中的未知細(xì)菌

由于噬菌體必須在細(xì)菌活體內(nèi)才能完成其復(fù)制，如果從標(biāo)本中檢出某種噬菌體常提示該樣本中有相應(yīng)的細(xì)菌存在。因此，如果用某種已知噬菌體作為診斷試劑，與臨床標(biāo)本在37 ℃孵育2～3 h，再檢測(cè)噬菌體的數(shù)量，如果噬菌體數(shù)量明顯增加，那就表明標(biāo)本中存在相應(yīng)的細(xì)菌。但在這種情況下，如果檢測(cè)獲得陽性結(jié)果，具有診斷意義；但若檢測(cè)為陰性結(jié)果，由于噬菌體的宿主譜可能不能覆蓋該菌種內(nèi)的所有菌株，故不具有排除診斷的意義。

4.3 用于細(xì)菌診斷的噬菌體新技術(shù)

從診斷角度考慮，可以利用噬菌體對(duì)細(xì)菌的“裂解活性”作為判斷指標(biāo)來建立診斷方法。此外，也可利用噬菌體與宿主菌之間的“特異性吸附”來建立診斷方法。噬菌體與細(xì)菌間的特異性吸附是通過其“受體結(jié)合蛋白”“RBP”與細(xì)菌受體的結(jié)合來完成的?！癛BP”實(shí)質(zhì)上是噬菌體與細(xì)菌受體結(jié)合的配體。但需要指出的是利用“特異性吸附”來建立的方法，其檢出率可能會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用“裂解活性”來建立的檢測(cè)。因?yàn)?，即使噬菌體完成了吸附、穿入步驟，如果噬菌體不能完成復(fù)制，也不會(huì)出現(xiàn)裂解活性。此時(shí)就只能檢測(cè)到“特異性吸附”，而不能檢測(cè)到“裂解活性”。下面介紹的新技術(shù)中，有的是基于裂解活性、有些是基于特異吸附的方法。

4.3.1噬菌體觸發(fā)的離子級(jí)聯(lián)感應(yīng)(sensing of phagetriggered ion cascade)技術(shù) 該方法是基于噬菌體在侵染細(xì)菌時(shí)，會(huì)在細(xì)胞膜上溶解出一微孔,造成胞內(nèi)離子外流,導(dǎo)致被稱為“電容”的細(xì)胞膜內(nèi)、外電勢(shì)差變化,此變化可被感應(yīng)和檢測(cè)。該方法是基于裂解活性的方法。本法的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)過程中不要求培養(yǎng)細(xì)菌,檢測(cè)的是活菌，且能被用于檢測(cè)活的但不能培養(yǎng)的細(xì)菌。

4.3.2基于噬菌體檢測(cè)細(xì)菌的生物發(fā)光法 該法在4 ℃條件下將噬菌體結(jié)合到甲苯磺?；罨拇胖樯?，通過噬菌體的RBP與目標(biāo)細(xì)菌結(jié)合，再通過磁性分離“噬菌體-磁珠-細(xì)菌”復(fù)合物，將其在37 ℃孵育，噬菌體進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制，并裂解細(xì)菌，釋放出細(xì)菌胞內(nèi)的ATP；繼之，通過“熒光素酶-ATP”生物發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌。該方法亦是基于裂解活性的方法。本方法有賴于噬菌體在活菌體內(nèi)完成其復(fù)制，故本法檢測(cè)到的只能是活的細(xì)菌，排除了死菌的干擾。

4.3.3基于噬菌體檢測(cè)細(xì)菌的電化學(xué)發(fā)光傳感器法 該方法將已知的噬菌體（或其RBP）與羧化石墨烯結(jié)合形成復(fù)合物，再將此復(fù)合物定位到玻璃碳電極上，形成電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescent，ECL）傳感器，用于檢測(cè)樣本中的目標(biāo)細(xì)菌。檢測(cè)過程中，由于噬菌體與細(xì)菌的結(jié)合，形成一個(gè)非導(dǎo)電生物復(fù)合物，阻遏了界面電子傳導(dǎo)，阻斷了ECL活性分子的擴(kuò)散，導(dǎo)致ECL的衰減。在一定范圍內(nèi)，這種ECL的衰減與樣本中的細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。故利用此電化學(xué)發(fā)光傳感器可實(shí)現(xiàn)樣本中的細(xì)菌檢測(cè)。本方法是一種非基于裂解活性的方法。

4.3.4利用基因工程表達(dá)的噬菌體RBP 檢測(cè)細(xì)菌該方法首先采用分子克隆技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體的RBP。RBP不具有裂解活性，但具有與細(xì)菌特異性結(jié)合的能力，因此可用作檢測(cè)細(xì)菌的試劑。在做RBP 克隆表達(dá)時(shí)，還可將編碼RBP 的基因與報(bào)告基因（如熒光蛋白基因、熒光素酶基因等）共表達(dá)。然后利用報(bào)告基因，將噬菌體與細(xì)菌之間的特異性結(jié)合轉(zhuǎn)化為一種可檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)。該方法是一種純粹基于特異性吸附的方法。

上述新方法尚處于探索之中，尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用，其根本原因是其覆蓋度尚難達(dá)到細(xì)菌“種”的范圍。

5 噬菌體在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

5.1 噬菌體在疾病預(yù)防中的應(yīng)用

噬菌體可調(diào)控特定環(huán)境中宿主菌的數(shù)量與分布。宿主菌達(dá)到一定數(shù)量，噬菌體就會(huì)繁殖起來；隨著噬菌體的繁殖，宿主菌數(shù)量又會(huì)被壓制下去。二者在動(dòng)力學(xué)上存在著此起彼伏的態(tài)勢(shì)。因此理論上講，可以利用噬菌體來調(diào)控某一特定環(huán)境中的病原體數(shù)量，從而達(dá)到防控疾病的目的。最近，臺(tái)灣慈濟(jì)醫(yī)院陳立光教授首次報(bào)道了這一機(jī)理的實(shí)踐應(yīng)用。從2009年開始，耐亞胺培南的鮑曼不動(dòng)桿菌在臺(tái)灣多地區(qū)（臺(tái)北區(qū)、中區(qū)、南區(qū)、高屏區(qū)及東區(qū)）流行，且形勢(shì)嚴(yán)峻。2015及2016年陳教授開始在流行最重的臺(tái)灣東區(qū)使用所研制“噬菌體清潔劑”，耐藥鮑曼得到很好控制。有人質(zhì)疑上述結(jié)果是否與噬菌體清潔劑使用有關(guān)，故2017 年刻意停止使用，當(dāng)年就又出現(xiàn)流行反復(fù)。2018 年重新使用了該噬菌體清潔劑，區(qū)域內(nèi)的鮑曼不動(dòng)桿菌流行重新得到控制。這項(xiàng)工作在臺(tái)灣獲得第13屆“臨床創(chuàng)新獎(jiǎng)”。從上述實(shí)例表明在一些特定環(huán)境，如ICU病房、燒傷病房等的特定區(qū)域內(nèi)，使用區(qū)域內(nèi)分離的優(yōu)勢(shì)流行菌株作為宿主菌分離的噬菌體，再用此噬菌體來控制該病原體所致疾病的流行是可行的。

5.2 噬菌體在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

與人類疾病的防治類似，噬菌體同樣可以用于牲畜和家禽類動(dòng)物的細(xì)菌感染性疾病的治療、診斷和預(yù)防。2006 年，美國FDA 批準(zhǔn)了某公司針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體制劑用于消除養(yǎng)殖禽類的細(xì)菌感染。由于動(dòng)物用噬菌體治療制劑應(yīng)用的準(zhǔn)入門檻較人用制劑低。因此，動(dòng)物用噬菌體治療制劑研制所承擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)更小，成本更低。研制動(dòng)物用噬菌體制劑更容易實(shí)現(xiàn)，也將更具有應(yīng)用前景。

沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、李斯特菌等是家畜或家禽中重要的感染性病原體。這些病原體引起的家畜或家禽感染性疾病死亡率很高，嚴(yán)重影響到家畜與家禽的生產(chǎn)。在魚和蝦的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，假單胞菌、殺鮭氣單胞菌、嗜水產(chǎn)氣單胞菌、發(fā)光弧菌、哈維弧菌、愛德華菌、嗜冷水螺菌常常是魚或蝦的重要病原體，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖危害很大。既往在畜牧、禽類及海產(chǎn)養(yǎng)殖中常常使用抗生素以保證產(chǎn)量，但由于抗生素使用引起的耐藥性擴(kuò)散以及抗生素殘留對(duì)人類健康帶來嚴(yán)重影響，引起了全球關(guān)注。各國相繼出臺(tái)了在動(dòng)物性食品生產(chǎn)中限制抗生素使用的相關(guān)政策。因此，使用噬菌體來防治家畜、家禽、魚蝦的細(xì)菌感染性疾病是一個(gè)值得開拓的領(lǐng)域。

有些植物病害是由細(xì)菌引起的，噬菌體對(duì)于植物根際和葉際病原菌具有防控潛力。2005 年，美國即批準(zhǔn)噬菌體制劑用于控制黃單胞菌和丁香假單胞菌引起的番茄和胡椒的斑點(diǎn)潰爛病。利用噬菌體來控制農(nóng)作物病害是一個(gè)具有光明前景的應(yīng)用領(lǐng)域[17]。

5.3 噬菌體在工業(yè)及飲食衛(wèi)生中的應(yīng)用

在發(fā)酵工業(yè)中，由于細(xì)菌污染常導(dǎo)致發(fā)酵失敗，造成嚴(yán)重?fù)p失。使用噬菌體控制發(fā)酵過程中的污染，早已在發(fā)酵工業(yè)中成功使用。

食源性感染是公共衛(wèi)生健康的主要威脅。WHO報(bào)告每年死于食物污染和水源性腹瀉者約200 萬人。食源性疾病導(dǎo)致美國每年約100 億美元～830 億美元的經(jīng)濟(jì)損失。噬菌體制劑可用于控制食品中的細(xì)菌生長(zhǎng)，使得食品得以保鮮，并控制食源性疾病的發(fā)生。在這一領(lǐng)域已有很多上市產(chǎn)品，美國FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)了4 種噬菌體制劑用于食品安全。美國環(huán)保機(jī)構(gòu)（EPA）也批準(zhǔn)了一種噬菌體制劑用于控制食品加工廠的細(xì)菌污染。這幾種制劑主要是針對(duì)李斯特菌、沙門氏菌的。

5.4 噬菌體在生物高技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用

與噬菌體有關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)、生物工程技術(shù)很多。有的已是常規(guī)技術(shù)，篇幅之限，不一一介紹，這里強(qiáng)調(diào)三個(gè)方面的應(yīng)用。

5.4.1轉(zhuǎn)座子文庫與細(xì)菌基因功能研究 噬菌體轉(zhuǎn)座子文庫是用轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染目標(biāo)菌株形成的文庫。一個(gè)高質(zhì)量的文庫，文庫中的每一個(gè)細(xì)菌都會(huì)被一個(gè)（且只能被一個(gè)）轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入，使該基因被插入失活。隨機(jī)挑取菌株，以轉(zhuǎn)座子序列為測(cè)序引物，側(cè)向測(cè)序至細(xì)菌基因組的一段序列，即可知道該菌體被插入失活的基因，以失活基因命名該菌株。如此反復(fù)隨機(jī)挑取菌株測(cè)序鑒定，直至挑取到每個(gè)基因的失活菌株，構(gòu)成一個(gè)轉(zhuǎn)座子失活基因的文庫。有些生物工程公司專門制作這種轉(zhuǎn)座子文庫，目前很多菌種都有商品化的轉(zhuǎn)座子文庫出售。有了這種轉(zhuǎn)座子文庫，為我們研究單基因失活后的表型變異及基因功能研究提供了基礎(chǔ)。目前，幾乎所有病原學(xué)細(xì)菌都有菌株被完成了全基因組測(cè)序，但通過注釋分析，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)超過半數(shù)的細(xì)菌基因都是功能未知基因。有的基因，雖然被注釋了一種功能，但這很可能只是該基因一個(gè)方面的功能，有些基因可能不止一種功能。因此，細(xì)菌的功能基因組學(xué)研究仍然任重道遠(yuǎn)。而轉(zhuǎn)座子文庫是我們研究基因功能的有用武器。

5.4.2噬菌體展示技術(shù)與生物制藥 噬菌體展示（phage display）技術(shù)是一種高效制備生物活性肽或蛋白質(zhì)分子的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。其原理是用欲表達(dá)的基因替換噬菌體的衣殼蛋白編碼基因，使欲制備的活性肽或蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)在噬菌體顆粒表面。用這樣重組的噬菌體感染宿主菌，獲得大量噬菌體顆粒，再從噬菌體顆?；厥漳繕?biāo)分子。這是一種制備生物活性肽或蛋白質(zhì)分子的非常有用的生物制藥技術(shù)。

5.4.3基因編輯技術(shù)與生物改造 近年，人們?cè)谘芯渴删w與宿主菌相互作用的過程中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的CRISPR/Cas 系統(tǒng)?；贑RISPR/Cas 的作用機(jī)制，建立起來了基因編輯技術(shù)。雖然，該系統(tǒng)中的Cas蛋白作為核酸切割酶，并不具有識(shí)別和特異切割DNA序列的特點(diǎn)，但在引導(dǎo)序列（guiding sequence）的引導(dǎo)下其切割活性就具備了特異性。而引導(dǎo)序列是可以人為任意合成的，這就使得我們有了在基因組上任意切割某一部位，或進(jìn)而插入目標(biāo)序列的技術(shù)手段，這就是基因編輯技術(shù)。基因編輯技術(shù)可用于編輯任何生物（包括人類）的基因組。但是，若將其用于編輯人體胚胎基因組時(shí)，在胚胎期被改變的基因組將存在于人體的所有有核細(xì)胞（包括生殖細(xì)胞），這就會(huì)導(dǎo)致被編輯的基因在人類擴(kuò)散，其危險(xiǎn)性是無法估計(jì)的。各國都嚴(yán)格禁止使用基因編輯技術(shù)來改變?nèi)梭w胚胎的基因組。因此，基因編輯技術(shù)用之于人體，僅限于編輯體細(xì)胞，用于治療單基因遺傳學(xué)疾病。而在微生物學(xué)中，基因編輯技術(shù)是制備微生物突變體的有力工具。

6 展望

噬菌體作為非細(xì)胞型病毒，嚴(yán)格寄生在前核細(xì)胞型微生物如細(xì)菌體內(nèi)。它的培養(yǎng)成本低，且易于遺傳造作。因此，噬菌體是生命科學(xué)領(lǐng)域研究生命現(xiàn)象及其規(guī)律的理想對(duì)象和材料。歷史上，噬菌體研究為今天的分子生物學(xué)、合成生物學(xué)、基因工程技術(shù)、及基因編輯技術(shù)等領(lǐng)域做出了不可磨滅的巨大貢獻(xiàn)。但人類在認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象的本質(zhì)及其規(guī)律方面，尚任重道遠(yuǎn)，相信噬菌體作為理想的研究對(duì)象和材料，將在生命科學(xué)領(lǐng)域繼續(xù)發(fā)揮重大作用。

噬菌體作為細(xì)菌的天敵，在抗細(xì)菌感染領(lǐng)域具有天然地應(yīng)用前景，但由于噬菌體的宿主譜太窄，嚴(yán)重限制了噬菌體治療的推廣與應(yīng)用。在如何突破噬菌體治療的限制性瓶頸、拓展噬菌體宿主譜、研發(fā)噬菌體基因編碼產(chǎn)物等領(lǐng)域，亟待取得突破。在細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)重的今天，超級(jí)細(xì)菌的感染已導(dǎo)致無有效抗生素可用，在抗耐藥性細(xì)菌感染方面，噬菌體治療可能是最佳選擇。

噬菌體應(yīng)用不僅僅限于疾病治療，它們?cè)诩膊≡\斷、疾病防控、獸醫(yī)領(lǐng)域、生物制藥、畜禽養(yǎng)殖、海產(chǎn)養(yǎng)殖、食品衛(wèi)生、工業(yè)發(fā)酵、土壤生態(tài)防治等領(lǐng)域都有著光明應(yīng)用前景。