崔普澤，胡彥建，賀旺，胡彥華

（1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 普通外科，黑龍江 哈爾濱 150086；2.哈爾濱工業(yè)大學附屬哈爾濱市第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150010）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，高居世界癌癥發(fā)病率第5位和癌癥病死率第4位[1]。盡管肝癌的5年生存率已從40 年前的3%提升到目前的18%，但仍遠遠低于全球發(fā)病率高的其他實體腫瘤，例如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌的5年生存率分別為65%、90%、98%[2]。美國肝癌死亡人數(shù)2000 年到2016 年增加了43%，從每10萬人死亡7.2人上升到10.3人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2030 年將有100 多萬患者死于肝癌[3]。提升肝癌生存率仍然是當今緊迫的難題。多種誘導腫瘤細胞凋亡的藥物和療法被證明對腫瘤治療有效，誘導肝癌細胞凋亡希望成為更有前途的肝癌治療方案。肝癌的發(fā)生和發(fā)展表現(xiàn)肝癌細胞凋亡的失調(diào)與大量細胞信號通路異常傳導密切相關，如PI3K/AKT/mToR[4]、Wnt/β-catenin[5]、ras/raf/MRPK[6]、NF-κB[7]、Hedgehog[8]、Notch[9]等。Notch信號通路在組織發(fā)育和生理過程中高度保守，調(diào)控細胞凋亡。包括肝癌在內(nèi)的各種肝臟疾病中，Notch信號通路均異常傳導[10]。Notch信號通路對肝癌細胞凋亡的作用因細胞和分子環(huán)境不同，表現(xiàn)出抑制或促進細胞凋亡的作用[11]。本文就Notch信號通路在肝癌細胞凋亡中的作用及其機制做一綜述。

1 Notch信號通路在細胞凋亡中的作用

Notch信號通路進化上高度保守，調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[12]。Notch信號通路主要包括依賴和非依賴細胞核內(nèi)轉錄因子CSL（C-promoter binding factor-1、CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）的兩種Notch信號通路活化方式。依賴CSL的經(jīng)典Notch信號傳導通路開始于細胞膜的相互接觸，Notch信號通路發(fā)送細胞（表達果蠅體內(nèi)的Delta和Serrate及線蟲體內(nèi)的lag-2，DSL配體）膜和鄰近的接受細胞（表達Notch受體）膜接觸，啟動Notch信號通路，信號接受細胞的Notch受體經(jīng)過金屬蛋白酶和γ-分泌酶介導的兩次連續(xù)切割，釋放Notch受體細胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細胞核內(nèi)，與細胞核內(nèi)轉錄因子CSL結合，從而激活Notch信號通路的靶基因HES和HEY家族，調(diào)節(jié)細胞凋亡相關基因表達，調(diào)控細胞凋亡。非依賴CSL的Notch信號通路NICD并不易位至細胞核內(nèi)，而是在胞漿中與其他信號通路（如β-catenin、PI3K/AKT等）蛋白相互作用，調(diào)控目標蛋白的表達，影響細胞的凋亡。細胞凋亡主要包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。外源性途徑又稱為死亡受體途徑，通過跨膜受體介導，活化天冬氨酸蛋白水解酶caspase家族，誘導細胞凋亡。內(nèi)源性途徑又稱線粒體途徑，刺激直接產(chǎn)生細胞內(nèi)信號，引起線粒體膜結構改變，釋放促凋亡物質，誘導細胞凋亡[13]。依賴CSL的經(jīng)典Notch信號通過Hes1-PTEN-AKT-mToR途徑調(diào)控細胞凋亡[14]，而非依賴CSL的Notch信號通路則通過NICD-mToR2-AKT-mToR介導細胞凋亡[15]。介于細胞類型不同和相關信號通路之間串擾的影響，Notch信號通路在同一腫瘤不同的細胞亞型和不同的腫瘤細胞系中表現(xiàn)出抑制和促進凋亡的不同作用[10，16]。Yoon等[17]通過轉染的方法，使唾腺癌細胞過度表達Notch信號通路，結果細胞凋亡率明顯下降，上調(diào)Notch信號通路抑制唾腺癌細胞凋亡。Wang等[18]應用小分子干擾RNA和γ-分泌酶抑制劑處理胰腺癌細胞，下調(diào)Notch信號通路，結果細胞凋亡率明顯增加，從而間接證實了活化的Notch信號通路抑制細胞凋亡。此外，NICD移位進入細胞核內(nèi)，激活Notch信號通路靶基因CDK2、VEGF和MMPS表達，抑制細胞凋亡[19-20]。Notch信號通路除表現(xiàn)抗凋亡作用，還表現(xiàn)促凋亡作用，例如在小鼠表皮和成年小鼠角膜上皮的研究中，Notch信號通路通過抑制β-catenin信號通路，促進細胞凋亡[21]。Notch信號通路對于同一細胞系的不同亞型亦表現(xiàn)出雙重的凋亡作用，Notch信號通路激活后保護1 型β細胞免于凋亡，當應用γ-secretase抑制劑（gamma secretase inhibitor，GSI）處理細胞，下調(diào)Notch信號通路后，1 型β細胞凋亡顯著增加，但對于2 型β細胞，采用GSI處理卻上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，抑制細胞凋亡[22]。Notch信號通路在細胞凋亡中表現(xiàn)的抑制和促進凋亡作用，主要依靠不同的組織類型和其與其他細胞信號通路間的“串話”。

2 Notch信號通路在肝癌細胞凋亡中的作用

肝癌的發(fā)生發(fā)展與Notch信號通路的異常傳導密切相關，因受肝細胞和肝臟成分細胞（如膽管細胞、內(nèi)皮細胞、星狀細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等）相互作用影響，不同肝癌組織中Notch信號通路呈上調(diào)或者下調(diào)的不同表達結果。Yang等[23]報道肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4受體表達水平明顯高于癌旁和正常肝臟組織，在肝癌和腫瘤周圍組織之間未發(fā)現(xiàn)Notch-2 表達差異，Notch-3 的表達增加與肝癌的血管浸潤性密切相關。Ahn等[24]研究取得了與Yang相同的Notch受體過表達結果，即肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4高表達，同時報道了Notch-1高表達的患者預后具有高復發(fā)風險。Hu等[25]報道與正常肝組織相比，Notch-3在HCC組織中高表達，且Notch-3高表達的腫瘤體積更大、腫瘤更早復發(fā)、腫瘤分期更晚和總生存期更短的特點。此外，除肝癌組織外，研究顯示HepG2 肝癌細胞系Notch-3受體、Jagged1和Deltal配體高表達[26]。然而，也有研究報道肝癌組織中Notch信號通路受體蛋白相對于正常肝組織低表達的結果。Sui等[27]收集肝癌組織樣本30例，通過qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)正常肝組織中Notch-1 mRNA的表達水平為（10.3±3.1），而肝癌組織中Notch-1 mRNA的表達水平為（5.1±2.1），肝癌細胞Notch-1 mRNA明顯低于肝正常細胞，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。蛋白質免疫印跡分析，顯示與正常肝組織相比，Notch-1蛋白的表達在肝癌組織中顯著降低（P＜0.001），同時還發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，肝癌細胞中NICD蛋白的表達顯著降低（P＜0.001）。Notch信號通路在肝癌組織胞中的“對向”差異性，促使其在肝癌細胞凋亡中呈現(xiàn)雙向作用。

2.1 下調(diào)Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡

Notch信號通路上調(diào)的肝癌細胞，Notch信號通路抑制細胞凋亡。下調(diào)Notch信號通路，解除Notch信號通路抑制肝癌細胞凋亡的關鍵因子，打開凋亡途徑，促進腫瘤細胞凋亡。

下調(diào)Notch信號通過PTEN/PI3K/AKT信號通路介導促進肝癌細胞凋亡。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN），是繼p53 后又一個與多腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的抑癌基因，其編碼具有蛋白磷酸酶和脂質磷酸酶雙重特異磷酸酶活性的蛋白，能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化；PTEN通過去磷酸化參與細胞調(diào)控。磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)細胞活動的重要方式，許多癌基因的產(chǎn)物都是通過磷酸化而刺激細胞生長[28]。PTEN主要抑癌機制是PI3K/AKT通路的主要負調(diào)控因子。PTEN可以使磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）催化產(chǎn)物第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）第三位的磷酸基團去磷酸化，從而對能促進細胞增殖生長的PI3K/Akt信號轉導途徑起到負調(diào)控作用。Tian等[29]在肝癌細胞系Huh-7 中過表達MicroRNA-760，下調(diào)Notch信號通路，增加PTEN蛋白表達，降低PI3K/AKT活性，結果凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3蛋白表達水平增加，肝癌細胞凋亡增加。Yang等[30]應用小分子干擾RNA處理HepG2細胞，抑制Notch1受體蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化的水平隨Notch1 受體蛋白表達的下降而降低，流式細胞結果顯示HepG2細胞凋亡明顯增加。下調(diào)Notch信號通路，解除HES對PTEN的抑制，上調(diào)PTEN蛋白的表達，從而抑制PI3K/AKT信號通路表達，誘導肝癌細胞凋亡。

Notch信號通路通過p53 介導調(diào)控肝癌細胞凋亡，p53是重要的腫瘤抑制基因，p53基因在正常情況下對細胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。p53 根據(jù)細胞DNA變異的程度而發(fā)揮不同作用，如果變異較小，p53 促使細胞自我修復，若DNA變異較大，p53誘導細胞凋亡。研究表明，Notch信號通路通過INK4a/ARF（inhibitor of CDK4/alternative of reading frame）的介導，干擾MDM2（murine double minute2）對p53的降解作用，下調(diào)Notch信號通路促進INK4a/ARF表達，減少MDM2對p53的降解作用，上調(diào)p53表達，誘導細胞凋亡[31]。Wang等[32]過表達RBP-Jinteracting and tubulin-associated（RITA），抑制Notch信號通路靶基因的轉錄，下調(diào)Notch信號通路靶基因HES1表達，結果發(fā)現(xiàn)RITA過表達增加p53的蛋白表達，誘導SMMC7721和HepG2細胞凋亡。Giovannini等[33]研究報道，沉默HepG2、SNU398和Hep3B細胞Notch3受體表達，導致p53上調(diào)，從而調(diào)控細胞周期蛋白G1表達以及miR-221和MDM2的前饋電路，促進肝癌細胞凋亡。

下調(diào)Notch信號通路通過內(nèi)、外源途徑調(diào)控肝癌細胞的凋亡。內(nèi)源途徑又稱線粒體途徑，主要是通過Bcl-2 和核蛋白改變線粒體膜結構。Bcl-2 家族主要包括：抗凋亡作用的Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-L及Bcl-w等和促凋亡作用的Bax、Bak及Bok等[34]。Zhang等[35]研究報道，秋水仙堿（Silybin，SIL）下調(diào)肝癌細胞Notch信號通路NICD，RBP-Jκ和Hes1蛋白表達，下調(diào)凋亡通路相關蛋白Bcl-2 表達，并上調(diào)Bax表達，誘導細胞凋亡。Kunnimalaiyaan等[36]報道，在肝癌細胞株（HepG2、Hep3B和SK-Hep-1）中下調(diào)Notch信號通路表達，靶蛋白HES-1表達下降，細胞凋亡增加，其機制是下調(diào)Notch信號通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，誘導凋亡小體形成。Ke等[37]通過藥物TQ（thymoquinome）處理肝癌細胞，下調(diào)Notch信號通路，取得的結果與Kunnimalaiyaan等[36]報道的一致，下調(diào)Notch信號通路通過內(nèi)源途徑調(diào)控肝癌細胞的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，凋亡蛋白Bax表達增加，肝癌細胞凋亡增加。外源性途徑又稱死亡受體途徑，主要由膜上死亡受體介導，導致caspase-8活化，誘導腫瘤細胞凋亡。Huang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA抑制Notch1的表達，有效的上調(diào)caspase-8表達，促進肝癌細胞H22的凋亡。

下調(diào)Notch信號通路配體Jagged1 表達，減少Notch信號通路激活，促進肝癌細胞凋亡。Ren等[39]報道，在肝癌細胞中過表達miR-199a-3p，有效地增加YAP1（yes associated protein 1）的表達，而YAP1直接抑制配體Jagged1表達，下調(diào)Notch信號通路激活，誘導肝癌凋亡。

下調(diào)動物體內(nèi)細胞Notch信號通路，促進肝癌細胞凋亡。Zeyada等[40]應用氯硝柳胺聚合物膠束處理肝癌小鼠，蛋白免疫印跡結果顯示Notch1受體和靶基因HES1表達顯著下降，凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的基因和蛋白表達水平增加，體內(nèi)抑制Notch信號通路，促進肝癌細胞凋亡。Xiang等[41]在異種移植荷瘤肝癌裸鼠中，應用藥物下調(diào)Notch信號通路表達，有效抑制腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡。

Notch信號通路通過PTEN/PI3K/AKT信號通路、p53介導，或是調(diào)控Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達等機制，誘導肝癌細胞凋亡，但是具體完整機制尚需要進一步的研究。

2.2 上調(diào)Notch信號通路誘導肝癌細胞凋亡

Notch信號通路促進腫瘤細胞凋亡的作用取決于腫瘤細胞的背景，除下調(diào)Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡外，上調(diào)Notch信號通路亦可以促進肝癌細胞凋亡。Sui等[27]研究報道，Notch1質粒轉染HepG2和Hep3B細胞，上調(diào)Notch信號通路，帶有Notch1質粒的陽性細胞凋亡率明顯高于對照（P＜0.001），上調(diào)Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡，其作用機制是轉染Notch1 質粒顯著激活了2 種細胞系中JNK的磷酸化。JNK可以使位于c-Jun蛋白N端的氨基酸殘基63和73磷酸化，上調(diào)caspase-3和Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達，促進肝癌細胞凋亡。此外，Wang等[42]報道了上調(diào)Notch信號通路，激活外源性細胞凋亡途徑，促進肝癌細胞凋亡的研究。研究人員將NICD轉染到肝癌SMMC7721 細胞中，結果轉染細胞24 h、48 h和72 h的細胞凋亡率呈現(xiàn)NICD劑量依賴性升高，其機制是上調(diào)的Notch信號通路，增加肝癌細胞p53表達，p53 的上調(diào)增加外源性細胞凋亡途徑TRAIL/DR5的表達，促進TRAIL誘導肝癌細胞凋亡。已有研究表明，TRAIL觸發(fā)的細胞凋亡是通過與死亡受體（DR4和DR5）結合并激活死亡受體來實現(xiàn)的，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族；死亡受體位于細胞表面，通過與配體TRAIL結合而變得三聚化，然后通過胱天蛋白酶級聯(lián)反應快速激活來傳遞凋亡信號[43]。Qi等[44]激活Notch信號通路在體內(nèi)體外均能誘導肝癌細胞凋亡，其機制是上調(diào)Notch信號通路增加p53的表達，高表達的p53可以通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達水平促進肝癌細胞凋亡。

上調(diào)Notch信號通路促進肝癌細胞凋亡，下調(diào)Notch信號通路亦可以誘導肝癌細胞凋亡。Notch信號通路對肝癌細胞的雙向作用，體現(xiàn)出Notch信號通路的傳導簡單性和作用復雜性的特點。進一步對Notch信號通路與其他細胞信號的“串話”研究，可能是解開Notch信號通路雙向調(diào)控肝癌細胞凋亡的關鍵所在。

3 小結與展望

肝癌細胞凋亡是一個復雜的生理過程，需要大量的信號通路共同作用。Notch信號通路與其他信號通路“串話”，表現(xiàn)出既抑制又促進肝癌細胞凋亡的雙向調(diào)控作用，這與肝癌細胞異質性密切相關，但詳細的分子機制尚需進一步研究。尋找Notch信號通路雙向調(diào)控肝癌細胞凋亡的關鍵點，打開Notch信號通路的細胞信號網(wǎng)絡，將為肝癌的靶向治療提供更廣闊的應用前景。