王若欣 張 勉

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱退行性關(guān)節(jié)炎，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨面出現(xiàn)垂直裂隙且伴有軟骨細(xì)胞/滑膜細(xì)胞反應(yīng)性增殖、關(guān)節(jié)囊中有骨及軟骨碎片等，但OA的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。目前對于OA的早期治療以非甾體類藥物治療為主，但藥物治療不良反應(yīng)明顯且最終仍無法避免關(guān)節(jié)軟骨的退變。晚期以手術(shù)治療為主，但是手術(shù)創(chuàng)傷大且費(fèi)用高昂[1，2]。近年來，以外泌體為對象的基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究逐漸興起，越來越多的研究表明，外泌體在OA的發(fā)展和治療中都有著極其特殊的作用，對外泌體的深入研究為明確OA的發(fā)病機(jī)制以及創(chuàng)新治療方式提供了新的前景。

一、骨關(guān)節(jié)炎定義及組織改變

一般而言，軟骨承受超負(fù)荷后會引起表面部位的變薄與結(jié)構(gòu)破壞，隨著時間的推移關(guān)節(jié)軟骨會進(jìn)一步凹陷破損，脫落的軟骨碎片進(jìn)入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，引起后續(xù)的一系列惡性反應(yīng)最終形成骨關(guān)節(jié)炎。正常軟骨由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)組成[3]。在發(fā)生OA的關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞損傷和修復(fù)失衡引起ECM結(jié)構(gòu)破壞。在溶酶體蛋白酶以及膠原酶的作用下，軟骨基質(zhì)內(nèi)的蛋白多糖成分急劇減少、膠原纖維變性，同時軟骨細(xì)胞退化且功能受損失去合成ECM的能力。隨著關(guān)節(jié)軟骨的病變，軟骨承載和緩沖力量的能力下降，軟骨下骨逐漸暴露并承受較大應(yīng)力和摩擦力，進(jìn)而出現(xiàn)局部骨折、骨壞死，而關(guān)節(jié)面和周圍的骨質(zhì)代償性增生形成骨贅，同時可能會伴隨骨囊性病變發(fā)生[4]。

二、外泌體的基本結(jié)構(gòu)與功能

外泌體(exosomes，EX)是一種由磷脂雙分子層膜包裹的囊泡，直徑通常在30～120nm左右，幾乎所有細(xì)胞都能夠分泌[5]。外泌體膜上富含膽固醇和鞘磷脂。此外，膜上還富含具有交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白、參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易?CD63、CD81、CD9等)、熱休克蛋白家族以及一些細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)。外泌體內(nèi)則含有眾多代謝相關(guān)酶類、核糖體蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等蛋白質(zhì)，以及mRNA和miRNA，這些生物活性物質(zhì)分別對不同的細(xì)胞發(fā)揮不同的生理作用。外泌體由宿主細(xì)胞釋放，作用于各種受體細(xì)胞，在免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)展、代謝調(diào)節(jié)等眾多生理、病理過程中均起到重要作用。通過外泌體進(jìn)行細(xì)胞間信息交流無需細(xì)胞直接接觸，外泌體同靶細(xì)胞上的膜受體結(jié)合，激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而改變受體細(xì)胞的活動與功能。此外部分外泌體膜能同靶細(xì)胞膜融合使外泌體內(nèi)的生物活性物質(zhì)直接進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用[6]。

三、外泌體在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的作用

OA的發(fā)生、發(fā)展受到多種因素的影響，目前外泌體作為熱門研究方向，為骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展機(jī)制提供了新的研究方向。

1.外泌體對關(guān)節(jié)軟骨的影響：關(guān)節(jié)內(nèi)存在促炎性細(xì)胞因子、抗炎性細(xì)胞因子和雙向作用因子，三者的動態(tài)平衡維持著關(guān)節(jié)軟骨正常的生理代謝。當(dāng)此動態(tài)平衡失調(diào)后，將會引起軟骨細(xì)胞代謝異常，誘發(fā)和促進(jìn)OA。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在關(guān)節(jié)腔中存在外泌體參與的成纖維細(xì)胞與軟骨細(xì)胞之間的正反饋通路，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[7]。當(dāng)用白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β處理滑膜成纖維細(xì)胞分泌的外泌體刺激OA軟骨細(xì)胞，能夠顯著上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13和結(jié)合蛋白序列的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(adisintegrin and metalloprotease with thrombospondinmotifs，ADAMTS)-5的表達(dá)，同時減少Ⅱ型膠原的分泌。此外，IL-1β處理后成纖維細(xì)胞分泌的外泌體中含有較豐富的IL-6、MMP-3、血管內(nèi)皮生長因子，這些細(xì)胞因子在OA早期發(fā)揮重要的促進(jìn)病變發(fā)展作用。

此外，IL-1β刺激成纖維細(xì)胞后有340個miRNA被上調(diào)、24個被下調(diào)，在其產(chǎn)生的外泌體中有11個miRNA被上調(diào)、39個被下調(diào)，在細(xì)胞和外泌體內(nèi)均被上調(diào)的miRNA有5個，這說明外泌體中的miRNA種類是細(xì)胞選擇性的結(jié)果。目前研究最廣的miR-4454受腫瘤壞死因子α刺激增多，miR-720在促進(jìn)細(xì)胞遷移中發(fā)揮作用[8，9]。成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌的外泌體可影響軟骨細(xì)胞的增殖、分化、遷移及分泌活動，在促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的同時減少蛋白聚糖的產(chǎn)生，增加細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解。以上研究表明，外泌體可減少正常軟骨細(xì)胞數(shù)目、降解細(xì)胞外基質(zhì)，影響關(guān)節(jié)軟骨的正常形態(tài)以及功能。

2.外泌體可作為OA潛在生物學(xué)標(biāo)志物：骨關(guān)節(jié)炎是漸進(jìn)性退行性疾病，目前主要檢測依靠患者自身感覺、影像學(xué)診斷和臨床特征性癥狀，仍缺乏統(tǒng)一的診斷學(xué)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的臨床診斷以及影像學(xué)檢查對于患者早期病癥缺乏敏感度，因此能夠明確的便于檢測的早期生物學(xué)改變，對于OA的診斷有重要意義。

細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到體液的外泌體能夠反映細(xì)胞的生理情況，故其有望作為部分疾病的發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志物[10]。在關(guān)節(jié)退行性病變早期，滑液中的Ⅱ型前膠原C端前肽表達(dá)增加，濃度升高，可預(yù)測早期的OA發(fā)生。而血清Ⅱ型膠原C末端肽和C端前肽濃度的動態(tài)聯(lián)合檢測對于OA的早期診斷以及嚴(yán)重程度預(yù)判有參考價值[11]。此外，ADAMTs與OA發(fā)展有關(guān)，早期OA患者中ADAMTs4水平高于中晚期患者，與ADAMTs1、3、5正好相反?；褐刑崛〉耐饷隗w內(nèi)高于正常濃度水平的miR-200C以及滑液中的相關(guān)促炎性細(xì)胞因子都可以作為標(biāo)志，而根據(jù)最新研究顯示，滑液中提取出的外泌體內(nèi)lncRNA PCGEM1可能是OA發(fā)展早期和晚期的區(qū)分標(biāo)識[12，13]。雖然外泌體具有作為生物學(xué)標(biāo)志物的潛力，但是到目前為止僅有少數(shù)因子有應(yīng)用價值。此外，軟骨組織、滑膜組織以及軟骨下骨產(chǎn)生的外泌體之間也會相互影響，再考慮到性別、年齡、種族、發(fā)病部位等因素，以及數(shù)量龐大的不同因子，還需要進(jìn)行更多的檢測與實(shí)驗(yàn)。

四、外泌體在骨關(guān)節(jié)炎治療中的作用

1.干細(xì)胞外泌體對OA治療的積極作用：目前很多研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)來源的外泌體(MSCs-EX)對治療OA有積極作用[14]。Zhang等[15]研究證實(shí)MSCs-EX能夠從多個方面緩解OA的發(fā)展。間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過介導(dǎo)動態(tài)修復(fù)進(jìn)程加快軟骨修復(fù)，在大鼠骨軟骨缺損處加入MSCs-EX處理后新軟骨組織形成顯著增多，s-GAG和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)顯著提升，同時Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)下降，軟骨深層組織中可觀察到有增大間隙的肥大軟骨細(xì)胞，軟骨下骨完全恢復(fù)，新生軟骨組織同原組織結(jié)構(gòu)整合良好。MSCs-EX增強(qiáng)細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞凋亡，MSCs-EX處理后軟骨組織和上覆滑膜組織中PCNA陽性細(xì)胞顯著增加，同時凋亡軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少。Liu等[16]也研究發(fā)現(xiàn)在小鼠OA模型中，MSCs-EX通過ln-cRNA-KLF3-AS1/miR-206/GIT1軸促進(jìn)OA中軟骨細(xì)胞的增殖并且抑制其凋亡。MSCs-EX促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化且同時減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子分泌。

MSCs-EX主要通過腺苷介導(dǎo)的AKT和ERK信號通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生存、增殖以及基質(zhì)合成[17]。當(dāng)外泌體作用于軟骨細(xì)胞時，AKT和ERK信號通路在1h內(nèi)開始磷酸化并在6h達(dá)到巔峰，說明MSCs-EX能夠很快地激活軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝活動快速增加和相關(guān)基因表達(dá)。此外，軟骨細(xì)胞通過攝取外泌體還可以對自身活動產(chǎn)生影響。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞在遇到MSCs-EX后會快速將其吞入胞內(nèi)，并且大部分吞入的外泌體會較長時間集中存在于胞質(zhì)內(nèi)，同時細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如生存素、Bcl-2、FGF-2等的mRNA水平會在細(xì)胞同MSCs-EX直接接觸24h后明顯上升。同時與細(xì)胞遷移、分化、基質(zhì)合成等活動相關(guān)的基因表達(dá)在4h后也有顯著提高。還有研究發(fā)現(xiàn)MSCs-EX可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，同時促進(jìn)IL-10等抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，因此MSCs-EX也具有一定的抗炎潛能。

2.外泌體miRNA對OA治療的作用：外泌體中含有大量的miRNA，miRNA通過調(diào)節(jié)組織中各種細(xì)胞的基因表達(dá)影響細(xì)胞的各項(xiàng)活動。外泌體miRNA除了作為OA早期生物學(xué)標(biāo)志物的潛在價值外，還有治療的潛在可能。

在MSCs-EX內(nèi)含有大量的miRNAs，可調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，較為主要的有ATK、ERK、SMAD等[18]。miR-125b和miR-320能夠通過下調(diào)ADAMTs而減輕OA的發(fā)展[19]。有關(guān)研究表明miR-23b是人間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中有重要調(diào)節(jié)作用，miR-221和miR-92a則有可能在促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和分化方面發(fā)揮作用[20]。此外，miR-140、miR-30a、miR-558、miR-476b和miR-142-3p也可以在抑制IL-1β和TNF-α這兩個促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，同時抑制它們下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

對外泌體進(jìn)行人工修飾或干預(yù)后治療OA目前也備受關(guān)注。Jones研究顯示滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有使軟骨再生的組織特異性，對于軟骨再生具有重要的潛力。外泌體是Wnt信號通路中的一種潛在的細(xì)胞外運(yùn)輸載體，外泌體中的Wnt5a/b通過激活Hippo-YAP信號通路中的YAP(yes-associated protein)，對抗經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號，減少包括轉(zhuǎn)錄因子SOX9在內(nèi)的主鏈β-catenin的基因表達(dá)，由此調(diào)控ECM的基因表達(dá)和軟骨形成[21,22]。Tao等[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體中Wnt5a/b含量較高，會激活YAP引起軟骨細(xì)胞的增殖和遷移，但是會引起SOX9表達(dá)降低以及ECM蛋白合成分減少。而miR-140-5p能夠通過增強(qiáng)SOX9以及蛋白聚糖的表達(dá)維持軟骨內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)進(jìn)而緩解OA的進(jìn)程，利用添加核酸的方法在滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial membrane-derived MSCs，SMMSCs)以及其外泌體中過表達(dá)miR-140-5p，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移的同時促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成ECM蛋白，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的高表達(dá)miR-140-5p的外泌體具有治療OA的潛力[24]。因此，外泌體內(nèi)miRNA為OA的治療提供了研究方向以及新策略。

3.抑制OA中炎性細(xì)胞外泌體對OA的治療作用：已有實(shí)驗(yàn)證明在OA中關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體及其內(nèi)容物起著促進(jìn)OA發(fā)展的作用，如果抑制了相關(guān)外泌體的作用就可能緩解OA的進(jìn)展。目前的研究主要集中在通過相關(guān)miRNA抑制物或者類似物(模擬物)抑制炎性細(xì)胞外泌體內(nèi)miRNA及炎性細(xì)胞因子作用減緩OA，例如通過向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miR-34a的抑制物，增加Col2a1降低 iNOS，進(jìn)而緩解OA發(fā)展過程[25]。滑膜也是目前研究可能的治療靶點(diǎn)之一，IL-6作為一種炎性介質(zhì)在OA中起調(diào)控作用，Chen等[26]研究數(shù)據(jù)顯示，通過抑制滑膜組織外泌體中IL-6含量對于治療滑膜炎以及OA可能有著較好療效。也有部分研究者在研究干擾特定靶點(diǎn)的新治療方法，包括抗纖維素抗體、TNF單克隆抗體、抗神經(jīng)生長因子抗體、抗蛋白酶(ADAMTs和MMPs)和緩激肽抗體等，用以對抗外泌體中相對應(yīng)的成分，從而發(fā)揮治療作用。此外還可以利用外泌體進(jìn)行基因治療，在關(guān)節(jié)局部導(dǎo)入含有高表達(dá)細(xì)胞因子基因或者細(xì)胞因子抑制劑基因的外泌體，使它們能夠緩慢且持續(xù)地在OA關(guān)節(jié)中發(fā)揮療效。

五、展 望

外泌體的發(fā)現(xiàn)為研究OA的發(fā)病機(jī)制、診斷與治療打開了新的大門。外泌體的內(nèi)容物會隨著OA病程的發(fā)展而改變，也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示在OA的早、中、晚期會有特定的細(xì)胞因子或miRNA等發(fā)生特定的上調(diào)或下降，故外泌體有可能在未來作為檢驗(yàn)OA的生物學(xué)標(biāo)志物。同時外泌體作為軟骨組織、滑膜組織、軟骨下骨等組織的樞紐，可激活不同的信號通路起傳遞信息的作用，進(jìn)而影響OA 的進(jìn)展。而MSC-EX可通過增加軟骨細(xì)胞增殖、減少軟骨細(xì)胞凋亡以及抑制炎癥等對損傷關(guān)節(jié)進(jìn)行修復(fù)，延緩疾病的發(fā)展。綜上所述，不同細(xì)胞來源的外泌體對于OA的發(fā)展和診療作用已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的影響，今后有必要對其進(jìn)行深入研究。