張冰娜，葉丹彥，張丹桂，李 璐，楊旅軍

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 汕頭 515041）

心血管疾病是世界范圍內(nèi)危害人體健康的重要疾病，其中心肌梗死是心血管疾病的最常見疾病之一.在中國，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年升高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢，嚴(yán)重危害著人們的健康，給社會和家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān).研究報道[1]，心肌細(xì)胞損傷時細(xì)胞自噬參與疾病的整個過程并發(fā)揮著重要作用.細(xì)胞自噬（autophagy）是指細(xì)胞應(yīng)對外部環(huán)境變化時的一種代謝方式，在基礎(chǔ)狀態(tài)下自噬水平較低，用于維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活；在缺血缺氧條件下，細(xì)胞能量或營養(yǎng)供應(yīng)不足，導(dǎo)致細(xì)胞自噬被顯著激活，激活的自噬小體可用于清除損壞的細(xì)胞器或侵入的病原體，廣泛參與各種病理生理過程[2].然而，其他研究指出缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞自噬過度激活，不利于心肌細(xì)胞存活[3].因此，準(zhǔn)確觀測細(xì)胞自噬小體的變化情況對于理解心肌損傷機(jī)制并及時作出正確干預(yù)具有重要臨床意義.

目前，普通型正置熒光顯微鏡由于其高分辨率被廣泛用于對樣品結(jié)構(gòu)和組成成分進(jìn)行定位和定性檢測.然而，正置顯微鏡技術(shù)存在成像速度慢、精確度有限及熒光散射偽影重等不足.激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，LCSM）作為一種先進(jìn)的細(xì)胞分析儀器，具有高精確度、高分辨率、高靈敏性以及高放大倍數(shù)等特性，可以在細(xì)胞層面對樣本進(jìn)行斷層、逐點、逐行和逐面等快速掃描成像，在生物醫(yī)學(xué)中具有廣泛應(yīng)用價值[4].因此，本研究旨在利用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)檢測低氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞損傷自噬小體變化情況.

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

儀器：激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SPE），正置熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51）.

試劑：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（美國，Gibco），0.25%胰蛋白酶，1倍的磷酸鹽緩沖液（PBS）.

細(xì)胞：胚胎小鼠心肌細(xì)胞.

1.2 低氧缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞自噬小體形成

將小鼠心肌細(xì)胞消化后接種于鋪有蓋玻片的六孔板中.待細(xì)胞長至80%，低氧誘導(dǎo)組換成缺氧液，于1% O2和5% CO2三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后復(fù)氧1 h.

1.3 免疫熒光染色

將低氧缺氧誘導(dǎo)組和對照組的培養(yǎng)基去除干凈，PBS洗3次，3 min/次.加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，3 min/次.加入0.1% TritonX-100透化15 min，PBS洗3次，3 min/次.加入山羊血清工作液封閉20 min，去除血清，加入稀釋的LC3A/B一抗（1∶250，Cell Signaling Technology#4180）4℃孵育過夜.用PBS洗3次，3 min/次，避光加入稀釋的山羊抗兔熒光二抗（1∶500，碧云天，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L））37℃孵育1 h，用PBS洗3次，3 min/次，加入DAPI工作液細(xì)胞核襯染（碧云天，Irving Blue（0.5%，SIGMA）細(xì)胞漿襯染，PBS洗凈后，鏡檢.（見表1）

1.4 應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡和正置熒光顯微鏡對圖片進(jìn)行采集

激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica TCS SPE）采集：Alexa Fluor 488激光激發(fā)波長：480～495 nm；Irving Blue激光激發(fā)波長：543～575 nm；DAPI激光激發(fā)波長359 nm.同時采集綠色、紅色、藍(lán)色以及三色疊加圖.

正置熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51）采集：選擇熒光濾鏡：1-DAPI、2-FITC、3-Rhod，分別采集藍(lán)色、綠色、紅色圖像，然后通過軟件將3圖進(jìn)行合并.

2 結(jié)果

2.1 低氧缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞自噬小體形成

細(xì)胞在氯喹抑制下出現(xiàn)了明顯的自噬小體.利用低氧環(huán)境+缺氧液方法誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞損傷并自噬小體形成是可行的.與正常對照組比較，低氧缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞損傷組自噬小體呈高表達(dá)狀態(tài).

2.2 正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體表達(dá)情況的差異

正置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測自噬小體表達(dá)情況如圖1（見封3）.自噬小體分泌的抗原可以與Alexa Fluor 488標(biāo)記的LC3A/B抗體結(jié)合，呈現(xiàn)綠色；DAPI襯染細(xì)胞核為藍(lán)色；Irving Blue襯染細(xì)胞漿呈紅色；3者疊加圖（Merge）可清晰觀察自噬小體在心肌細(xì)胞內(nèi)的位置及表達(dá)情況.與正置顯微鏡比較，激光共聚焦顯微鏡成像速度快，圖像清晰及靈敏度高.

3 討論

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞內(nèi)一種非常重要的生理過程，主要通過亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化并經(jīng)溶酶體介導(dǎo)對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)和膜磷脂進(jìn)行降解，維持細(xì)胞合成和代謝的平衡，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定.本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧缺氧誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞損失可以引起自噬小體高表達(dá)，與既往類似研究適度刺激引起的細(xì)胞自噬作用對缺氧心肌細(xì)胞具有一定保護(hù)作用的結(jié)果基本一致[5].細(xì)胞自噬起始于自噬小體的形成，當(dāng)細(xì)胞自噬被激活時，自噬小體表達(dá)的LC3發(fā)生膜型轉(zhuǎn)化，主要分布在細(xì)胞膜上；細(xì)胞自噬未被激活時，LC3仍停留在細(xì)胞漿內(nèi)，呈散在塊狀分布[6].現(xiàn)在普遍觀點認(rèn)為，在心肌病變早期細(xì)胞自噬被認(rèn)為是一種保護(hù)性機(jī)制.然而，有研究指出過度激活細(xì)胞自噬，不利于心肌細(xì)胞的存活[3].因此，快速準(zhǔn)確檢測細(xì)胞自噬時自噬小體的表達(dá)情況對于指導(dǎo)臨床干預(yù)具有重要應(yīng)用價值.

免疫熒光法是目前檢測自噬小體的常用方法，主要儀器包括普通正置熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡.普通正置熒光顯微鏡由于操作方便、費用低和儀器比較普遍等特點被廣泛應(yīng)用于實驗研究.然而，正置熒光顯微鏡在使用過程中只能局限于單個波長拍照，之后再合并不同通道的圖像，存在成像速度慢等缺點.另外，正置熒光顯微鏡會隨著次級熒光的干擾，使圖像清晰度下降，同時也會受曝光時間、增益影響，出現(xiàn)不同熒光染料的交叉干擾，無法在需要高靈敏度的實驗中獲取精確圖像[7].除此之外，正置熒光顯微鏡需要人肉眼觀察得出結(jié)果，存在主觀因素的干擾，無法客觀準(zhǔn)確地對自噬小體的位置和含量進(jìn)行評估.激光共聚焦掃描顯微鏡作為一種先進(jìn)的熒光成像技術(shù)，主要利用激光作為掃描光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術(shù)，對樣本進(jìn)行快速的點、線或二維圖像成像[4，8].由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，其分辨率大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍.另外，激光共聚焦掃描顯微鏡不僅可以通過多通道熒光捕獲技術(shù)同時獲取多標(biāo)記熒光圖像，減少多色熒光之間的波段疊加，抑制圖像的模糊；還可以與其他多種先進(jìn)技術(shù)兼容達(dá)到聯(lián)合應(yīng)用的目的[9].總之，激光共聚焦掃描顯微鏡已成為分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、藥理學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域強(qiáng)有力的研究工具.

隨著科學(xué)研究的不斷深入，激光共聚焦掃描顯微鏡在細(xì)胞結(jié)構(gòu)[10]、核酸及蛋白質(zhì)[11]、細(xì)胞內(nèi)自由基活性[12]、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化[13]、膜電位[14]等生命科學(xué)研究中發(fā)揮重要的作用.近年來，新開發(fā)的高速活細(xì)胞雙轉(zhuǎn)盤式共聚焦系統(tǒng)進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度、圖像的采集速度，同時降低了光毒性.因此，激光共聚焦掃描顯微鏡具有檢測速度快、靈敏度高、定位精確和多色熒光成像等優(yōu)點，可以直接探測活細(xì)胞在化學(xué)因子、細(xì)胞因子或激素等作用下所致的離子細(xì)微動態(tài)變化，是目前檢測自噬小體變化的最為先進(jìn)儀器之一.