劉書培，張秀森，李婉瑩，趙 迪，楊 澤，張旭東，原 翔

人體內(nèi)大約有30萬億個(gè)細(xì)菌[1]。自從人類微生物組項(xiàng)目完成以來[2]，對(duì)微生物在人類健康中所起的作用越來越感興趣，許多研究已經(jīng)將微生物群落的變化與全身狀況聯(lián)系起來，如動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥性腸病、過敏和糖尿病[3-5]。在受微生物群影響的全身疾病中，癌癥也不例外。很多腫瘤患者體內(nèi)微生物群的變異和腫瘤組織內(nèi)的異常微生物已被確定為腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵標(biāo)志物。口腔微生物組可以影響食管微生物組，從而可能促進(jìn)ESCC的發(fā)生[6-7]。這一概念為微生物群和ESCC發(fā)展之間的關(guān)系增加了另一層復(fù)雜性。ESCC是胃腸道侵襲性最強(qiáng)的腫瘤之一，發(fā)病率也在逐年上升[8]。既往研究報(bào)道唾液中P.gingivalis的數(shù)量與口腔癌和ESCC的進(jìn)展有關(guān)。在ESCC組織中P.gingivalis增多，并且這種感染與ESCC患者較短的生存時(shí)間密切相關(guān)。此外，較高的血清抗P.gingivalis抗體水平對(duì)ESCC的診斷和預(yù)后也具有重要意義。所有這些均支持P.gingivalis是ESCC的關(guān)鍵因素之一，并可能對(duì)ESCC的發(fā)生、進(jìn)展和治療反應(yīng)產(chǎn)生影響[9]。

ESCC是發(fā)展中國家食管癌的主要組織學(xué)亞型，在中國是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[8]。ESCC死亡率高，主要因?yàn)榇蠖鄶?shù)病例在最初診斷時(shí)已經(jīng)到了疾病終末期，盡管有多種治療手段，ESCC患者的5 a總生存率也僅為10%[8]。因此，尋求預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)和靶向治療的新方法至關(guān)重要。本文就近年來P.gingivalis與ESCC相關(guān)性及其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 毒力因子

P.gingivalis是一種革蘭氏陰性專性厭氧桿菌，可表達(dá)多種毒力因子，包括菌毛、牙齦蛋白酶、血凝素、外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等[10]，主要的致病機(jī)制為造成免疫防御失調(diào)[11]。P.gingivalis是一種胞內(nèi)致病菌，可侵襲多種真核細(xì)胞，改變其表達(dá)，規(guī)避宿主的免疫防御，造成再次感染。此外，它還能與宿主相互作用并在組織中定植。P.gingivalis可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)微生物生物膜的增殖，從而破壞宿主的穩(wěn)態(tài)[11]。

為了有效定植，P.gingivalis分泌蛋白黏附素、血凝素和蛋白酶。P.gingivalis OMVs在CTD (C-terminal domain-family)蛋白中表現(xiàn)出豐富的選擇性，支持細(xì)菌內(nèi)聚，促進(jìn)生物膜的發(fā)育，并作為轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)菌的中間體[12]。精氨酸特異性蛋白酶(Arg-specific gingipain,Rgp)和賴氨酸特異性蛋白酶(Lys-specific gingipain,Kgp)是半胱氨酸蛋白酶，屬于細(xì)胞外蛋白酶，對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均有多種作用。這些半胱氨酸蛋白酶能夠廣泛降解結(jié)締組織和宿主防御分子。Rgp和Kgp被證明通過激活激肽級(jí)聯(lián)和補(bǔ)體C3和C5蛋白的液相轉(zhuǎn)化，與炎癥緩解和宿主防御高度相關(guān)。除了這些防御，一些其他因素，如菌毛、血凝素、脂多糖、鞭毛和主要外膜蛋白，也被證明具有潛在的毒性[13]。

2 肽基精氨酸脫亞胺酶和蛋白質(zhì)瓜氨酸化在癌癥發(fā)病中的潛在作用

P.gingivalis是目前已知的唯一產(chǎn)生肽基精氨酸脫亞胺酶(peptidyl-arginine deimi-nase，PAD)的病原體。這種酶通過脫去蛋白質(zhì)和肽中的精氨酸殘基來修飾細(xì)菌和宿主蛋白質(zhì)，將它們轉(zhuǎn)化為瓜氨酸[14-16]。蛋白質(zhì)瓜氨酸化通過改變蛋白質(zhì)原有三維結(jié)構(gòu)和功能的空間排列來解除對(duì)宿主炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[17]。宿主的內(nèi)源性瓜氨酸來自5種鈣依賴酶，稱為肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD 1，2，3，4/5和6)，這些酶與PAD非常相似，但又不完全相同[18-20]。宿主PADs與多種人類和動(dòng)物癌癥有關(guān)。使用泛PAD抑制劑氯脒(Clam)抑制細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的脫氨基作用，可以抑制腫瘤進(jìn)展和炎癥癥狀[21]。

3 P.gingivalis通過激活NF-kB信號(hào)通路來促進(jìn)ESCC

細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和C-Myc是G1-S轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[22]。Western印跡和RT-PCR分析表明，在P.gingivalis刺激后，Cyclin D1和C-Myc的表達(dá)上調(diào)。在P.gingivalis刺激后，核中NF-kB(P65)的表達(dá)也上調(diào)[23]。Cyclin D1和C-MYC是NF-kB途徑的下游靶標(biāo)[24]。另外，MMP2和BCL-XL的表達(dá)在蛋白質(zhì)和mRNA水平上也上調(diào)。熒光素酶測(cè)定結(jié)果表明，ECA109和KYSE510細(xì)胞P.gingivalis刺激中，NF-kB的活性增加。相反，對(duì)照組中NF-kB的活性降低。這些表明，P.gingivalis發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，并且可能是ESCC進(jìn)展中NF-kB激活的重要刺激。NF-kB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)對(duì)感染的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且該途徑與ESCC發(fā)展有關(guān)[23,25]?？偟膩碚f，這些研究表明，P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC細(xì)胞的增殖遷移可能與NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)的激活有關(guān)，因此可作為ESCC的治療干預(yù)的目標(biāo)[23,26]。

4 P.gingivalis通過TGF-β依賴的Smad/YAP/TAZ信號(hào)促進(jìn)ESCC的進(jìn)展

P.gingivalis的內(nèi)化通過轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)依賴的 Smads/YAP/TAZ (Yes-associated protein YAP65 homolog/Transcriptional coactivator with pdz binding motif)的激活，增強(qiáng)ESCC的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)[27]。P.gingivalis細(xì)胞內(nèi)定植誘導(dǎo)的糖蛋白A重復(fù)序列(Glycoprotein-A repetitions predominant，GARP)上調(diào)加速TGFβ生物活性，推動(dòng)ESCC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。其中，P.gingivalis還能誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制劑和凋亡相關(guān)基因的上調(diào)，表明TGFβ信號(hào)通路是一個(gè)中介。值得注意的是，與野生型P.gingivalis相比，fimbrillin A (fimA)缺乏的P.gingivalis表現(xiàn)出增殖能力、遷移能力、侵襲能力和細(xì)胞內(nèi)侵襲能力以及Smad2/3磷酸化能力的下降[28]。提示FimA通過TGFβ/Smad信號(hào)通路部分參與P.gingivalis的腫瘤促進(jìn)作用。值得注意的是，ESCC中牙齦鏈球菌的數(shù)量與GARP、pSmad2、YAP/TAZ、Snail、TGFβ1和Oct4蛋白水平呈正相關(guān)[29]。此外，GARP與pSmad2、pSmad2與YAP/TAZ、YAP/TAZ與Oct4均存在顯著相關(guān)[30]。有證據(jù)表明，Hippo通路的效應(yīng)子YAP/TAZ通過與Smads復(fù)合物結(jié)合，響應(yīng)TGFβ來控制TGFβ/Smad信號(hào)通路[31]。此外，YAP/TAZ在ESCC中的致癌作用是必需的，因?yàn)閅AP/TAZ缺失或YAP S94A/TAZ S51A突變體的過表達(dá)消除了P.gingivalis誘導(dǎo)的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明，P.gingivalis刺激的YAP/TAZ活性是TGFβ/Smads信號(hào)通路介導(dǎo)的P.gingivalis.腫瘤促進(jìn)功能的必要前提，而YAP/TAZ核積累可以消除這一功能。總之，基于P.gingivalis誘導(dǎo)的ESCC進(jìn)展的復(fù)雜通路，其闡明了TGF-β規(guī)范信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)[29]。

5 P.gingivalis通過修飾多種凋亡和細(xì)胞周期信號(hào)通路提高ESCC細(xì)胞的生存能力

胞內(nèi)P.gingivalis感染后，通過短時(shí)間內(nèi)增加PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)上皮細(xì)胞的存活和增殖，從而抑制細(xì)胞凋亡。此外，P.gingivalis通過分泌其效應(yīng)蛋白核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate Kinase，NDK)，阻斷細(xì)胞外ATP/P2X7危險(xiǎn)信號(hào)，保護(hù)自己和宿主上皮細(xì)胞免受線粒體和NOX2產(chǎn)生ROS的損害[32]。EMT是通過GSK3-β的失活而促進(jìn)的[33]，GSK3-β通過增加Snail、Slug和β-catenin轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和可用性促進(jìn)E-cadherin向Vimentin的轉(zhuǎn)換[34]。β-catenin還上調(diào)cyclin、ZEB1和MMPs，導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖和遷移增加[35]。P.gingivalis通過其效應(yīng)蛋白NDK直接磷酸化HSP27，從而繼續(xù)促進(jìn)EMT，導(dǎo)致前MMP9水平的增加[36]。P.gingivalis增加了腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44和CD133的表達(dá)[37]。此外，P.gingivalis通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子以及B7-H1和B7-DC受體的表達(dá)增加來調(diào)節(jié)免疫環(huán)境，導(dǎo)致活化的T細(xì)胞凋亡[38]。

信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT3)對(duì)于P.gingivalis介導(dǎo)的口腔上皮細(xì)胞耐化學(xué)誘導(dǎo)凋亡和ESCC的可控進(jìn)展具有關(guān)鍵作用。與對(duì)照組相比，P.gingivalis感染增強(qiáng)了紫杉醇處理的細(xì)胞中STAT3的表達(dá)，但降低了caspase-3的表達(dá)。提示STAT3和caspase-3的差異調(diào)控是P.gingivalis蛋白誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞抗凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路[28]。此外，WP1066對(duì)STAT3的化學(xué)抑制可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并消除P.gingivalis對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抗性的影響[39]。此外，抑制STAT3使P.gingivalis蛋白在紫杉醇處理的細(xì)胞中減少caspase-3，表明STAT3和caspase-3之間可能存在連接。證明STAT3和caspase-3信號(hào)是P.gingivalis誘導(dǎo)的抗凋亡信號(hào)的重要組成部分[40-41]。P.gingivalis刺激顯著增強(qiáng)了Cyclin D3和E1的表達(dá)。此外，P.gingivalis感染增強(qiáng)了KYSE30細(xì)胞中Thr 160處CDK2的磷酸化，這可以通過與cyclin蛋白結(jié)合增加活性并促進(jìn)G1-S期轉(zhuǎn)變和S期進(jìn)展，表明P.gingivalis可以利用細(xì)胞周期機(jī)制加速ESCC細(xì)胞的增殖[6]。

6 P.gingivalis的IgA或IgG水平和ESCC患者的預(yù)后關(guān)系

ESCC患者中抗P.gingivalis的血清中位IgA和IgG水平顯著高于食管炎患者和健康對(duì)照組。傳統(tǒng)的ESCC血清標(biāo)志物如鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCCA)[42]、癌胚抗原(CEA)[43]、CYFRA21-1和糖類抗原CA199對(duì)ESCC的早期檢測(cè)和進(jìn)展沒有足夠的敏感性和特異性[9]。其中IgA對(duì)早期ESCC的診斷效果明顯優(yōu)于IgG (54.54% VS 20.45%)[9]。此外，血清中抗P.gingivalis的IgA或IgG水平高與ESCC患者的預(yù)后較差相關(guān)，特別是在0～Ⅱ期或陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。同時(shí)具有高IgA和IgG的患者預(yù)后最差。因此，結(jié)合IgA和IgG可以提高診斷，改善預(yù)后。P.gingivalis蛋白血清生物標(biāo)志物對(duì)于早期檢測(cè)ESCC具有重要意義，并可能提高診斷和預(yù)后性能[9]。

7 P.gingivalis引起的癌變也有助于潛在致癌物的代謝

乙醛(ACH)是酒精的第一代謝物，是人類的第一類致癌物[44]。與口腔衛(wèi)生良好的個(gè)體相比，口腔衛(wèi)生不良的受試者體外唾液乙酰膽堿產(chǎn)生量高出2倍。P.gingivalis將乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，能夠誘導(dǎo)DNA損傷、誘變和上皮細(xì)胞的增殖。這可能部分地有助于解釋為什么酗酒和某些癌癥相關(guān)[6,45]。

近幾年來，微生物感染引起全身性疾病的發(fā)病率顯著上升，但疾病與發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性尚不清楚。微生物、炎癥和宿主細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)都是致癌因素[46],但尚不清楚哪些因素起主導(dǎo)作用，以及它們之間存在怎樣的相互作用。P.gingivalis感染與ESCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并與ESCC患者預(yù)后不良相關(guān)。此外，在體外和體內(nèi)，P.gingivalis感染促進(jìn)ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)，并使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。微生物可作為疾病診斷和監(jiān)測(cè)的新的標(biāo)志物。微生物在腫瘤發(fā)生過程中的特定靶點(diǎn)也可用于精確的靶向治療[47]。進(jìn)一步探討P.gingivalis的發(fā)病機(jī)制，可以為癌癥防治提供新的方向，提高患者的健康水平和生活質(zhì)量。