苗恒，梁建宏

(北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科，眼病與視光醫(yī)學(xué)研究所，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診治研究北京市重點實驗室，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部眼視光學(xué)院，北京 100044)

眼內(nèi)淋巴瘤是一種主要累及葡萄膜、視網(wǎng)膜和玻璃體的惡性腫瘤性疾病，按主要累及組織和部位可分為玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤和葡萄膜淋巴瘤[1]。約90%的眼內(nèi)淋巴瘤起源于B淋巴細胞，此外起源于T淋巴細胞和NK/T細胞的眼內(nèi)淋巴瘤也偶有報道[2]。玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的病理類型多為彌漫大B細胞淋巴瘤，而葡萄膜淋巴瘤則多起源于黏膜相關(guān)淋巴組織，病理類型多為結(jié)外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤[3]。眼內(nèi)淋巴瘤大多起病隱匿、進展緩慢，葡萄膜淋巴瘤更因惰性度高而一度被認為是良性淋巴增生性疾病[3]。雖然眼內(nèi)淋巴瘤具備相對特征性眼底和影像學(xué)表現(xiàn)，但因其表型多樣且經(jīng)常伴隨不同程度的眼內(nèi)炎性表現(xiàn)而被誤診、漏診。

隨著多模式影像、微量標(biāo)本分子和細胞生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，眼內(nèi)淋巴瘤的診斷率和檢出率逐年提高，眼科醫(yī)生對此類疾病的認識也逐年加深[4]。雖然眼內(nèi)組織/細胞病理至今仍然是眼內(nèi)淋巴瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但受限于采樣技術(shù)、標(biāo)本保存/運輸、病理診斷技術(shù)水平等因素，眼內(nèi)淋巴瘤病理診斷陽性率始終偏低[5]。相比之下，只需要少許眼內(nèi)液即可輕松完成的細胞因子檢測、流式細胞免疫分型和基因重排等技術(shù)則具備標(biāo)本獲取和保存難度低、檢測方法成熟且方便等優(yōu)勢，備受臨床醫(yī)生推崇，甚至大有在診斷眼內(nèi)淋巴瘤時只單純依據(jù)此類分子/細胞生物學(xué)的方法而完全放棄病理診斷的趨勢。認識眼內(nèi)液分子/細胞生物學(xué)檢測手段的優(yōu)勢和局限性，重視并規(guī)范眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷流程，不但有助于加深對該類疾病臨床表現(xiàn)的認識，還有助于借助分子/細胞生物學(xué)手段探究其發(fā)病機制，為優(yōu)化此類疾病的治療方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 認識眼內(nèi)液分子/細胞生物學(xué)檢測手段的優(yōu)勢和局限性

目前臨床用于診斷眼內(nèi)淋巴瘤的分子/細胞生物學(xué)手段主要包括白細胞介素10/6比值(interleukin 10/6，IL-10/6)、免疫球蛋白重鏈/T細胞受體(immunoglobulin heavy chain/T cell receptor，IgH/TCR)基因重排和流式細胞免疫分型技術(shù)[4]。

IL-10/6因標(biāo)本來源簡單及檢測方法成熟快捷等原因而被廣泛用于臨床疑似眼內(nèi)淋巴瘤患者的篩查環(huán)節(jié)。房水IL-10/6>1診斷眼內(nèi)淋巴瘤的敏感性為75%～88%，特異性為75%～85%，而玻璃體IL-10/6>1診斷眼內(nèi)淋巴瘤的敏感性和特異性更是分別高達93%和100%[6]。但需要指出的是，該方法成立的前提：患眼為玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤，腫瘤細胞來源于B淋巴細胞，且要排除可導(dǎo)致IL-10升高的其他原因。葡萄膜淋巴瘤常惰性生長且位于血-視網(wǎng)膜外屏障之外，因而很難通過脈絡(luò)膜活檢之外的方法明確診斷，眼內(nèi)液IL-10/6也通常<1[7]。雖然>90%的眼內(nèi)淋巴瘤均來源于B淋巴細胞，但少數(shù)情況下，T淋巴細胞和NK/T細胞來源的眼內(nèi)淋巴瘤也可發(fā)生，但此時IL-10并不升高，因而會造成IL-10/6<1的現(xiàn)象。此外，已有報道[8]表明，眼內(nèi)淋巴瘤之外的疾病如處于特定階段的急性視網(wǎng)膜壞死等，也可出現(xiàn)IL-10水平升高甚至IL-10/6>1的情況，此時需要臨床醫(yī)生結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)和患眼對治療的反應(yīng)以明確診斷。

IgH/TCR基因重排技術(shù)是一種基于PCR判斷標(biāo)本中是否存在單克隆淋巴細胞的分子生物學(xué)手段。在血液腫瘤領(lǐng)域，IgH/TCR基因重排已具備標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程(EuroClonality/BIOMED-2指南)且已是確定診斷的常規(guī)依據(jù)之一[9]。但在眼科領(lǐng)域，受到標(biāo)本采集量，特別是標(biāo)本微切(micro-dissection)技術(shù)實現(xiàn)難度大的限制，該技術(shù)至今仍沒有標(biāo)準(zhǔn)化流程可循，直接將眼內(nèi)液標(biāo)本整體或離心后取沉淀送檢的假陰性率仍然偏高(約40%)[10]。此外，基因重排結(jié)果陽性僅表示該標(biāo)本中存在單克隆的B/T淋巴細胞，卻并不表示此類細胞一定是腫瘤細胞。炎癥背景下的淋巴細胞單克隆反應(yīng)性增生也是基因重排陽性的原因之一[11]。因此在獲得基因重排陽性結(jié)果后，還要綜合其他診斷手段判斷其性質(zhì)，而不能據(jù)此確診眼內(nèi)淋巴瘤。

流式細胞免疫分型是基于流式細胞術(shù)和大樣本數(shù)據(jù)的細胞定量分型技術(shù)，可快速計數(shù)標(biāo)本中特殊免疫表型的細胞數(shù)量和百分比，同樣也是血液腫瘤診斷的常規(guī)檢測項目之一。在眼科領(lǐng)域，因眼內(nèi)液標(biāo)本獲取相對困難且細胞密度低，標(biāo)本分裝后用于流式細胞免疫分型的細胞總數(shù)通常至多只有2 000個，且因標(biāo)本采集、保存、運輸、處理等原因，“不典型”免疫表型的細胞常見。此外，如同基因重排一樣，即便檢測到κ/λ限制性表達的淋巴細胞，也只能說明標(biāo)本中存在單克隆的淋巴細胞，但其意義不明[12]，因而不能作為眼內(nèi)淋巴瘤的確診依據(jù)。

IL-10/6、IgH/TCR基因重排和流式細胞免疫分型技術(shù)都是依據(jù)淋巴瘤細胞的生物學(xué)特性，檢測其存在時可能發(fā)生的繼發(fā)現(xiàn)象，進而間接推理其存在的方法，任何一種方法均不能直接“見到”也不能確定腫瘤細胞的存在。雖然該類檢測方法具有簡便和高效的特征，但終究不能作為眼內(nèi)淋巴瘤的確診依據(jù)或診斷金標(biāo)準(zhǔn)。

2 重視眼內(nèi)組織/細胞病理對眼內(nèi)淋巴瘤的診斷價值

病理是腫瘤類疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。對眼內(nèi)淋巴瘤而言，獲得病理依據(jù)不但可以明確診斷，還可根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷其病理類型并預(yù)測預(yù)后。雖然相比現(xiàn)今各種眼內(nèi)液分子/細胞生物學(xué)檢測手段，眼內(nèi)組織/細胞病理具備采樣難度大，標(biāo)本保存運輸困難，受各地病理診斷水平限制等短板，但不容置疑的是，眼內(nèi)組織/細胞病理可在直視下證實腫瘤細胞的存在，因而仍然是眼內(nèi)淋巴瘤的診斷金標(biāo)準(zhǔn)方法，是此類疾病診斷時必不可或缺的送檢項目之一。雖然因各種原因，其敏感性低于眼內(nèi)液分子/細胞生物學(xué)手段，但也不能因此而放棄送檢病理標(biāo)本甚至忽視其重要性。

3 規(guī)范和優(yōu)化眼內(nèi)組織/細胞病理標(biāo)本的采集、保存和送檢流程

有效采集眼內(nèi)組織/細胞病理標(biāo)本可顯著改善眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷效率。1)采樣前應(yīng)停用糖皮質(zhì)激素類藥物至少2周以避免其誘導(dǎo)的淋巴細胞凋亡[13]。2)采樣時首選玻璃體切割術(shù)中標(biāo)本，切速≤800 min?1，且在不打開灌注的情況下干切眼底病灶附近的玻璃體，提高腫瘤細胞采集陽性率[13]。3)采樣時同時采集玻璃體原液和灌洗液并分別送檢可提高陽性率[14-15]。4)玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤患眼首選玻璃體標(biāo)本，而葡萄膜淋巴瘤則需根據(jù)腫瘤累及部位和標(biāo)本獲取的難易程度判斷標(biāo)本種類和標(biāo)本獲取方式：若腫瘤只累及脈絡(luò)膜則只能選擇脈絡(luò)膜標(biāo)本，但若腫瘤同時/主要/只累及睫狀體，則經(jīng)鞏膜入路的睫狀體活檢為首選方法，對同時/主要/只累及虹膜的患眼則可經(jīng)角鞏膜緣入路獲取虹膜標(biāo)本[16]。對首次玻璃體標(biāo)本活檢陰性但仍高度疑似玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤的患眼，可進行二次玻璃體活檢或選擇病灶處視網(wǎng)膜活檢；因淋巴瘤細胞主要位于視網(wǎng)膜色素上皮與Bruch膜之間，送檢組織應(yīng)包含視網(wǎng)膜色素上皮層及其附近組織[17]。5)玻璃體標(biāo)本在采集后應(yīng)立即放入細胞培養(yǎng)液中(如含葡萄糖的RPMI1640)并于1 h內(nèi)送病理科[18]。如果能在取材后立即就地完成甩片和固定過程而后再送檢則形態(tài)更佳。6)固定液可顯著影響腫瘤細胞形態(tài)，PreservCyt固定液可有效保護淋巴瘤細胞的形態(tài)和DNA的完整性[19]。7)玻璃體原液在離心后，上清可送檢IL-10/6，沉淀重懸后可送檢病理和IgH/TCR基因重排。而灌洗液則可在離心后取沉淀，重懸后送檢流式細胞免疫分型，以最大化利用標(biāo)本[17]。8)細胞病理甩片標(biāo)本可進一步通過標(biāo)本微切(micro-dissection)技術(shù)切取其中高度疑似腫瘤細胞的部分進行IgH/TCR基因重排檢測，以提高其陽性率[20]。

綜上，眼內(nèi)液分子/細胞生物學(xué)技術(shù)雖然簡便快捷，但因其本身只能作為眼內(nèi)淋巴瘤診斷的“間接證據(jù)”而不能作為確診依據(jù)。眼內(nèi)組織/細胞病理仍然是眼內(nèi)淋巴瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，其價值和地位不能被其他任何分子/細胞生物學(xué)檢測手段所替代。規(guī)范和優(yōu)化眼內(nèi)組織/細胞病理標(biāo)本的采集、保留和送檢流程對提高眼內(nèi)淋巴瘤的病理診斷率有重要意義。眼科醫(yī)生應(yīng)充分理解并掌握各種診斷、檢測技術(shù)的優(yōu)勢和局限性，在臨床工作中有側(cè)重的選擇恰當(dāng)?shù)脑\斷技術(shù)，提高眼內(nèi)淋巴瘤的診斷效率，提高醫(yī)療質(zhì)量。

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