朱淑新

（衡水學(xué)院，河北衡水 053000）

1 材料與方法

月季莖段采自衡水學(xué)院校園內(nèi)綠化帶選取當(dāng)年生木質(zhì)化枝條。

1.1 材料的處理及試驗(yàn)方法

1.1.1 配置培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS（蔗糖25g/L+瓊脂條7.5g/L，pH 值5.8～6.0）培養(yǎng)基。

1.1.2 取材。選取1 年生的月季枝條，剪去頂部和基部，并去除葉片及葉柄，用清水沖洗數(shù)次，用枝剪截成長1～2cm 莖段（每個(gè)莖段上至少有1 個(gè)葉芽），放置大燒杯中用清水浸泡30min 后將清水倒出，再將莖段用70%乙醇溶液浸泡30s 后倒出溶液。

1.1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。0.1%HgCl2處理月季莖段，浸泡時(shí)間分別為9min、13min、15min、18min、25min，共5 個(gè)處理，重復(fù)3 次；20%84 消毒液處理莖段，浸泡時(shí)間分別為5min、15min、30min、45min，共4 個(gè)處理，重復(fù)3 次。

1.1.4 接種。在超凈工作臺上，將每個(gè)處理的月季枝條接種到培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿接種3 個(gè)莖段。

1.2 培養(yǎng)條件

此試驗(yàn)在衡水學(xué)院生物系樓組培試驗(yàn)室中進(jìn)行，將接種好的培養(yǎng)皿置于組織培養(yǎng)室中，光照強(qiáng)度為2000Lx，光照時(shí)間為10～12h，溫度為25℃±2℃，10d后觀察生長情況，并統(tǒng)計(jì)污染的莖段、無菌的莖段，以及莖段死亡的情況，并計(jì)算污染率、無菌率和死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間20%84 消毒液對月季莖段消毒效果的影響

從表1 可以看出，利用70%乙醇處理30s 后，用20%84 消毒液處理月季莖段，隨著處理時(shí)間的不斷加長，莖段污染率呈直線下降趨勢，而無菌率恰好相反。以20%84 消毒液處理5min 后，莖段污染率最高，達(dá)66.67%，無菌率最低，為33.33%；主要是由于處理時(shí)間較短，未徹底消滅外植體上細(xì)菌的緣故。而20%84 消毒液處理45min 后，莖段污染率最低，為13.33%，無菌率最高，達(dá)86.67%；且各處理時(shí)間均無死亡現(xiàn)象。

表1 20%84 消毒液對月季莖段消毒效果的影響

2.2 不同處理時(shí)間的0.1% HgCl2 溶液對月季莖段消毒效果的影響

從表2 可以看出，利用70%乙醇處理30s 后，用0.1%HgCl2溶液處理月季莖段，隨著處理時(shí)間的不斷加長，莖段污染率呈下降趨勢，無菌率呈上升趨勢，且較平緩。用0.1%HgCl2溶液處理7min 后，莖段污染率最高，為36.67%，無菌率最低，為63.33%；而以0.1%HgCl2處理18min 后消毒效果最佳，莖段污染率最低，為0，無菌率最高，達(dá)98.33%。用0.1%HgCl2溶液處理月季莖段的各時(shí)間處理中都有少量枝條死亡的現(xiàn)象。用0.1%HgCl2溶液處理外植體，處理7min 后的污染率最高，是由于消毒不徹底所致；當(dāng)處理時(shí)間加長時(shí)，污染率降低、成活率下降，是由于HgCl2自身毒性影響，將外植體表面的微生物徹底殺死的同時(shí)，也破壞了外植體組織和表層細(xì)胞[1]，導(dǎo)致外植體死亡。

表2 0.1%HgCl2 溶液對月季莖段消毒效果的影響

2.3 不同種消毒液對月季莖段消毒效果的影響

從表3 可以看出，利用70%乙醇處理月季莖段30s 后，分別用20%84 消毒液和0.1%HgCl2溶液處理，用20%84 消毒液處理月季莖段45min，有8 段被污染，52 段未被污染，無菌率達(dá)86.67%，死亡數(shù)為0段；用0.1%HgCl2處理月季莖段18min 有0 段被污染，59 段未被污染，無菌率高達(dá)98.33%，死亡數(shù)為1 段。在消毒效果方面來看，0.1%HgCl2溶液處理18min 的消毒效果更好。通過方差分析比較，用20%84 消毒液處理45min 和用0.1%HgCl2處理18min 對月季莖段的消毒效果差異顯著。從時(shí)間方面來看，用0.1%HgCl2溶液處理18min 后的消毒效果比20% 84 消毒液處理45min 后的消毒效果要好，說明0.1%HgCl2溶液具有高效性。但是用0.1%HgCl2溶液處理月季莖段18min時(shí)無污染莖段，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。原因是HgCl2溶液毒性較大，具有較高的殺傷性，不僅將外植體表面的微生物徹底殺死了，還傷害了外植體組織和表層細(xì)胞[1]。用0.1%HgCl2溶液對月季莖段消毒時(shí)間再次加長，月季莖段的死亡數(shù)目可能還會增加，不利于試驗(yàn)所要達(dá)到的預(yù)期效果，影響試驗(yàn)數(shù)據(jù)的正確性，從而影響試驗(yàn)結(jié)果的確定性。

表3 不同種消毒液對月季莖段消毒效果的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

應(yīng)用0.1%HgCl2和20%84 消毒液對月季進(jìn)行不同時(shí)間段的消毒處理試驗(yàn)表明：20%84 消毒液處理月季莖段45min 消毒效果較佳，無菌率達(dá)86.67%；0.1%HgCl2溶液處理月季莖段18min 的消毒效果最佳，無菌率達(dá)98.33%。通過方差分析比較，用20%84 消毒液處理45min 和用0.1%HgCl2處理18min 對月季莖段的消毒效果差異顯著。但由于HgCl2溶液毒性較大，出現(xiàn)月季莖段死亡現(xiàn)象

3.2 討論

植物組織培養(yǎng)受光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、濕度、培養(yǎng)基等多方面的因素影響，在試驗(yàn)過程中會遇到很多問題。試驗(yàn)操作前要對操作臺及其它試驗(yàn)用具（比如鑷子）進(jìn)行一定時(shí)間的消毒處理，保證接種室十分清潔。在進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)，要注意配制的母液要及時(shí)使用，植物材料長期暴露在室外會影響試驗(yàn)的準(zhǔn)確性；每接種一段外植體都要把鑷子放在酒精燈上方用外焰烤幾秒消毒后，再接種下一段外植體；接種完一個(gè)培養(yǎng)皿，鑷子都要放在一個(gè)特定的地方，操作一段時(shí)間后要對操作臺進(jìn)行消毒處理，避免人為的操作失誤影響試驗(yàn)結(jié)果，預(yù)防接種苗出現(xiàn)玻璃化、褐化[1]等現(xiàn)象。植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)對操作過程要求十分嚴(yán)格，每一個(gè)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)都可能造成試驗(yàn)失敗。本試驗(yàn)第1 次采取校園外綠化帶里的月季枝條，試驗(yàn)數(shù)據(jù)很不理想，出現(xiàn)嚴(yán)重死亡現(xiàn)象；第2 次采用校園內(nèi)的月季枝條，經(jīng)同樣的操作步驟，試驗(yàn)數(shù)據(jù)較為理想，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為以后的科研工作提供理論依據(jù)。兩次試驗(yàn)出現(xiàn)較大差異，是因?yàn)樾Ｍ饩G化帶長期在充滿汽車尾氣以及粉塵的環(huán)境中生長，月季受到嚴(yán)重污染，表層附著著諸多污染物，甚至內(nèi)部也已遭到一定程度破壞，影響試驗(yàn)結(jié)果；校內(nèi)的月季潔凈，易于清理，對試驗(yàn)影響較小，在進(jìn)行科研工作時(shí)，要選擇潔凈的試驗(yàn)材料，得到的數(shù)據(jù)才會更加準(zhǔn)確。

用20%的84 消毒液處理月季枝條45min，無菌率僅為86.67%，還不是最好的消毒時(shí)間，實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)更多的時(shí)間梯度，比如說50min、55min 等時(shí)間梯度，找出最好的消毒時(shí)間。

用70%乙醇處理莖段的時(shí)間不同，得出的結(jié)論也不盡相同。王洪興[1]進(jìn)行君子蘭的組培試驗(yàn)，該研究摸索出君子蘭的最佳消毒方法是利用70%乙醇處理40s后，利用NaClO 處理20min。類比得出，用70%乙醇處理月季莖段40s 效果會更好。

利用HgCl2雖然消毒效果較好，但是藥品本身毒性比較大，有時(shí)會因?yàn)榻輹r(shí)間過長破壞了外植體表層甚至內(nèi)部組織的活性，并且廢液會對環(huán)境保護(hù)造成較大影響，在利用0.1%HgCl2溶液對外植體消毒試驗(yàn)時(shí)，需要謹(jǐn)慎操作，要合理處理廢液。

在植物組織培養(yǎng)科研工作中，每一步操作都要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡M(jìn)行，消毒液的選用尤為重要，理想的消毒劑應(yīng)具備殺菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)、效果穩(wěn)定性好、毒性低、刺激性小（最好是無毒、無殘留、無刺激），且易溶于水，對人和動(dòng)物安全及廉價(jià)易得[2]。在今后的科研工作中，有關(guān)科研單位應(yīng)根據(jù)市場需求情況和要求，從合理復(fù)配、合成新化合物、生產(chǎn)工藝等多角度、多方位研發(fā)新型消毒劑，從而提高我國消毒劑的科技含量，對植物組培技術(shù)有更近一步的研究，建立更好的再生體系，向社會提供更好的產(chǎn)品。