李凡，劉久石，李斌，齊耀東，張本剛，劉海濤，肖培根

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

哮喘是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥[1]，具有氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等特征[2]。其病理機(jī)制復(fù)雜、發(fā)病急、病程長(zhǎng)、難以根治。尋找療效好且安全性好的藥物對(duì)于哮喘的治療十分重要。中醫(yī)藥治療哮喘歷史悠久、臨床療效良好、并發(fā)癥少且安全性好，在治療哮喘方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

丹龍口服液是2017 年我國(guó)首個(gè)獲批上市的中藥新藥，也是我國(guó)實(shí)行藥品上市許可人制度后第一個(gè)獲批上市的中藥新藥[3]。該藥以中醫(yī)辨證論治為原則，由丹參、炙麻黃、地龍等組成[4]，是首個(gè)以丹參作為君藥治療哮喘的中成藥，表明丹參在治療哮喘方面具有重要功效。丹參用于肺部疾病治療早有研究，中西醫(yī)匯通學(xué)派的代表人物張錫純[5]在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中提出，丹參配伍的中藥組方可治療肺癰等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參可通過(guò)腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)因子/成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14（TWEAK/Fn14）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smads（TGF-β1/Smads）信號(hào)通路[6]、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路[7]等改善卵白蛋白（OVA）誘導(dǎo)的小鼠哮喘炎癥。丹龍定喘湯可抑制哮喘小鼠血清中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）的表達(dá)，改善氣道重塑[8]。臨床數(shù)據(jù)也顯示，采用丹參注射液聯(lián)合曲安奈德對(duì)支氣管哮喘急性發(fā)作期患者進(jìn)行治療，總有效率達(dá)77%，治療效果較好[9]；使用丹參川芎嗪輔助治療支氣管哮喘30 例效果顯著，能有效減少支氣管哮喘復(fù)發(fā)[10]，提示丹參是治療哮喘的有效藥物。目前，丹參治療哮喘的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制尚不明確，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建丹參治療哮喘的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)加以驗(yàn)證，模擬化合物與靶點(diǎn)的相互作用，對(duì)結(jié)合模式和結(jié)合能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，研究關(guān)鍵靶點(diǎn)與丹參主要化學(xué)成分之間的相互作用，初步揭示丹參治療哮喘的活性成分、作用靶點(diǎn)和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 丹參活性成分及靶點(diǎn)篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）[11]檢索丹參的化學(xué)成分，以藥動(dòng)學(xué)中吸收、分布、代謝和排泄（ADME）屬性口服生物利用度（OB）≥30%及類(lèi)藥性（DL）≥0.18作為篩選條件[12-14]，對(duì)丹參成分進(jìn)行初篩以獲得活性化合物，進(jìn)一步獲取其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。借助UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白和基因信息校正，獲得丹參主要成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.2 哮喘靶點(diǎn)篩選

以“asthma”作為檢索關(guān)鍵詞，利用GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）、TTD（http://systemsdock.unit.Oist.jp/iddp/home/index）、DrugBank（http://www.drugbank.ca/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)收集哮喘靶點(diǎn)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中取Score＞中位數(shù)的靶點(diǎn)作為哮喘的潛在靶點(diǎn)。合并疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)，在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中校正基因信息，經(jīng)過(guò)檢索和校對(duì)去重后確定哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1.3 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確丹參靶點(diǎn)與哮喘潛在靶點(diǎn)間的相互作用，運(yùn)用R 語(yǔ)言將兩者靶點(diǎn)取交集，獲得丹參治療哮喘的靶點(diǎn)，提交至STRING 11.0 在線(xiàn)平臺(tái)（https://string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)定聚類(lèi)方法為“kmeans clustering”，運(yùn)用Cytoscape 3.5.1分析得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape 3.5.1 中的MCODE插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算和分析，包括鄰節(jié)點(diǎn)子圖（neighbors）、密度（density）、以該點(diǎn)為種子節(jié)點(diǎn)所擴(kuò)展出的最大值的K-core等信息，得到按照Score排序的4個(gè)功能模塊。運(yùn)用CytoHubba篩選得到度（degree）值排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 功能與通路的富集分析

基于Metascape在線(xiàn)平臺(tái)（https://metascape.org/gp/index.html）對(duì)丹參治療哮喘的靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）及基因本體（GO）分析，運(yùn)用R語(yǔ)言對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.5 丹參成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將丹參活性成分、治療哮喘的靶點(diǎn)及信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1 平臺(tái)，構(gòu)建丹參成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。其中，丹參活性成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路在網(wǎng)絡(luò)中以節(jié)點(diǎn)（node）表示；各節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系以邊（edge）表示。

1.6 丹參治療哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)模擬化合物與靶點(diǎn)的相互作用，對(duì)結(jié)合模式和結(jié)合能力進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用MOE 2019和PyMol 軟件對(duì)獲得的主要靶點(diǎn)和主要的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)與丹參主要化學(xué)成分之間的相互作用。通過(guò)PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org）篩選靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，選擇物種為“Homo sapiens”，實(shí)驗(yàn)方法為“X-RAY DIFFRACTION”，高分子實(shí)體類(lèi)型為“Protein”，選擇較低分辨率的蛋白晶體作為對(duì)接的模板。在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下載丹參活性成分的2D 結(jié)構(gòu)（mol2 格式）。將靶點(diǎn)與活性成分導(dǎo)入MOE 2019 軟件，進(jìn)行預(yù)處理和對(duì)接位點(diǎn)尋找，之后進(jìn)行分子對(duì)接。運(yùn)用R 語(yǔ)言繪制對(duì)接結(jié)果熱圖，用PyMol軟件顯示對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 丹參活性成分及靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP獲得丹參化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)換為基因名。剔除無(wú)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息后，得到59 個(gè)潛在的活性成分（表1），進(jìn)一步篩選得到其對(duì)應(yīng)的135個(gè)可能靶點(diǎn)。

表1 丹參主要活性成分

續(xù)表1

2.2 哮喘靶點(diǎn)

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得哮喘靶點(diǎn)5974 個(gè)。設(shè)定Score＞中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為哮喘的潛在靶點(diǎn)，其中Score 最大值為73.99，最小值為0.17，中位數(shù)為0.94，故設(shè)定Score≥0.94的靶點(diǎn)為哮喘的潛在靶點(diǎn)。剔除數(shù)據(jù)后，得到3298 個(gè)靶點(diǎn)。從OMIM、TTD、DrugBank、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲得哮喘靶點(diǎn)36、147、11、1312 個(gè)。合并所有哮喘靶點(diǎn)后刪除重復(fù)值，在UniProt平臺(tái)上校正疾病基因名，最終獲得3824個(gè)哮喘靶點(diǎn)。

2.3 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將篩選的丹參成分靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)取交集，通過(guò)R 語(yǔ)言繪制韋恩圖，得到丹參成分-哮喘共同靶點(diǎn)108 個(gè)（圖1A）。將靶點(diǎn)提交至STRING 11.0 平臺(tái)，運(yùn)用Cytoscape 3.5.1 軟件處理得到丹參靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖1B）。Jun、前列腺素E2（PTGS2）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、蛋白激酶B1（Akt1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等結(jié)合分?jǐn)?shù)都較高且度值較大，表明這些靶點(diǎn)可能在丹參治療哮喘中起關(guān)鍵作用。獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)后，利用Cytoscape 3.5.1軟件中的MCODE 插件對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行聚類(lèi)分析，得分值最高的子網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1C。利用CytoHubba 插件得到按照度值排名前10 的關(guān)鍵基因（圖1D），依次為Akt1、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、Fos、IL-6、Jun、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、PTGS2、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）。

圖1 丹參治療哮喘靶點(diǎn)PPI分析

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

將丹參治療哮喘的靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Metascape平臺(tái)進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路分析和GO 分析，并用R 語(yǔ)言繪制結(jié)果圖（圖2）。依據(jù)P＜0.01、涉及靶點(diǎn)數(shù)量≥3、富集因子＞1.5，篩選出關(guān)鍵的20 條通路（圖2A）。結(jié)果顯示，丹參治療哮喘的靶點(diǎn)富集通路主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt、NF-κB、Janus激酶-STAT（JAK-STAT）等通路，提示這些經(jīng)典通路可能在丹參治療哮喘中發(fā)揮著重要作用。

設(shè)定相同的篩選條件得到GO 分析結(jié)果。GO 分析表明，丹參通過(guò)作用體內(nèi)的多個(gè)位置和多種生物學(xué)過(guò)程發(fā)揮治療哮喘的作用。細(xì)胞組分（CC）分析表明，靶點(diǎn)的產(chǎn)物可能主要在細(xì)胞膜的功能筏（membrane raft）、突觸后膜（postsynaptic membrane）等部位（圖2B）；分子功能（MF）分析表明，靶點(diǎn)可能是通過(guò)G 蛋白偶聯(lián)胺受體（G protein-coupled amine receptor activity）、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)（neurotransmitter receptor activity）等發(fā)揮作用（圖2C）；生物學(xué)過(guò)程（BP）分析則提示，細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路（cytokine-mediated signaling pathway）在丹參治療哮喘中比較重要（圖2D）。

圖2 丹參治療哮喘交集靶點(diǎn)的KEGG及GO分析（排名前20位）

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

以上述得到的丹參治療哮喘的59 個(gè)潛在成分、108個(gè)交集靶點(diǎn)與20條關(guān)鍵通路為基礎(chǔ)，構(gòu)建“network”與“type”文件，輸入至Cytoscape 3.5.1構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。如圖3所示，丹參通過(guò)59個(gè)成分、108個(gè)靶點(diǎn)、20條關(guān)鍵通路協(xié)同調(diào)控治療哮喘。

圖3 丹參治療哮喘的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將上述實(shí)驗(yàn)篩選出的3 個(gè)主要活性成分木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮與10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)Akt1、EGFR、Fos、IL-6、Jun、MAPK1、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。結(jié)果表明，參與分子對(duì)接化合物打分值均為負(fù)數(shù)（表2），打分值大多＜-5，表明化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合力。隱丹參酮可與PTGS2 的Tyr385、Ser530 2 個(gè)氨基酸殘基作用（圖4A），打分值為-7.382 5；丹參酮ⅡA與MAPK1 的Ile31、Met108、Asp106、Gln105殘基相互作用（圖4B），打分值為-5.408 9；木犀草素可以與EGFR（Met793、Gln791、Met790、Lys745、Asp837，圖 4C）和 PTGS2（Tyr385、Ser530，圖4D）相互作用，打分值分別為-7.167 1、-7.211 0。分子對(duì)接結(jié)果提示，丹參重要活性成分與疾病靶點(diǎn)生物親和力高，具有良好的活性。

圖4 丹參有效成分與靶點(diǎn)部分分子對(duì)接結(jié)果

表2 丹參有效成分與靶點(diǎn)對(duì)接打分

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析并探討丹參治療哮喘的活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并基于分子對(duì)接初步模擬其可能分子作用機(jī)制。氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的2 個(gè)主要病理學(xué)特征。本研究發(fā)現(xiàn)，丹參可通過(guò)影響氣道重塑和緩解氣道炎癥發(fā)揮治療哮喘的作用。丹參主要含脂溶性的丹參酮類(lèi)及水溶性的黃酮類(lèi)化合物[15]，本研究結(jié)果表明，丹參中59 個(gè)化學(xué)成分可通過(guò)作用于108 個(gè)靶點(diǎn)與20 條信號(hào)通路在治療哮喘發(fā)揮作用。隱丹參酮和丹參酮ⅡA均是丹參中主要的脂溶性丹參酮類(lèi)成分，屬二萜醌類(lèi)。隱丹參酮可降低哮喘小鼠氣道周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)和輔助性T 細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞因子分泌，從而改善哮喘[16]。丹參酮ⅡA可降低血栓素B2等表達(dá)，緩解支氣管平滑肌收縮和血小板聚集，通過(guò)調(diào)節(jié)微循環(huán)障達(dá)到緩解哮喘的效果[17]。木犀草素是丹參中主要的黃酮類(lèi)化合物，可抑制IL-4、IL-5、IL-13 等Th2 型細(xì)胞因子的合成，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕哮喘炎癥繼而緩解哮喘癥狀[18-19]。隱丹參酮、丹參酮ⅡA和木犀草素3 個(gè)化合物通過(guò)Akt1、EGFR、Jun、IL-6、Fos 等10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)介導(dǎo)PI3KAkt、NF-κB、JAK-STAT 3 個(gè)關(guān)鍵通路參與調(diào)控哮喘（圖5）。

圖5 丹參治療哮喘的作用機(jī)制

PI3K-Akt 信號(hào)通路是與細(xì)胞內(nèi)與磷脂酰肌醇有關(guān)的通路[20]，可參與調(diào)節(jié)哮喘。Akt1 是PI3K 直接作用的下游靶點(diǎn)，木犀草素可通過(guò)抑制Akt1 的磷酸化介導(dǎo)PI3K-Akt 信號(hào)通路，減少小鼠氣道平滑肌增殖從而緩解哮喘[21]。

NF-κB 通路被激活后可促進(jìn)與哮喘有關(guān)的多種炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，誘發(fā)哮喘發(fā)病或加重哮喘癥狀。隱丹參酮可能通過(guò)TNF 等靶點(diǎn)影響NF-κB 抑制劑-α（NFKBIA）、p65 NF-κB 的磷酸化和TLR4 的表達(dá)而抑制NF-κB 通路，使肺組織中巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增加得到抑制，并減弱過(guò)氧化物酶（MPO）活性[22]。丹參酮ⅡA可通過(guò)NFKBIA 等抑制TNF-α、TLR4和NF-κB mRNA 和蛋白的表達(dá)，通過(guò)抑制TLR4/NF-κB 通路減輕炎癥損傷，從而減輕哮喘炎癥[23]。

JAK-STAT通路是細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的通路，被認(rèn)為與支氣管哮喘有關(guān)[24-25]。IL-6 是支氣管哮喘的主要炎癥因子，哮喘急性發(fā)作時(shí)，IL-6 作用于B 細(xì)胞和T 細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白E（IgE）生成[26]；IL-6與受體結(jié)合后也可活化JAK1，通過(guò)磷酸化STAT3，激活JAK-STAT 通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致支氣管平滑肌痙攣和氣道炎癥。木犀草素等可降低IL-6 的表達(dá)，減少I(mǎi)gE 生成并進(jìn)一步阻礙STAT3 活化，通過(guò)抑制JAK-STAT 通路達(dá)到改善肺部炎癥、緩解支氣管平滑肌痙攣、緩解哮喘的效果。

丹參中的丹參酮ⅡA和木犀草素還可通過(guò)降低肺組織中MMP-9 水平，減少大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕支氣管管壁和平滑肌增生程度，改善氣道重建[27]。MMP-9 是與哮喘關(guān)系密切的基質(zhì)金屬蛋白酶，可特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)，使其結(jié)構(gòu)重建，同時(shí)誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞遷移并影響氣道平滑肌細(xì)胞增殖與遷移，進(jìn)而誘發(fā)哮喘氣道重建。木犀草素還可抑制白細(xì)胞介素-13受體α2（IL-13Ra2）的表達(dá)，從而抑制氣道壁的增厚和平滑肌增殖，減輕氣道重塑[28]。此外，丹參酮ⅡA、木犀草素等還可通過(guò)下調(diào)哮喘肺組織中的Fos[29]、Jun[30]、EGFR[31]的表達(dá)以拮抗氣道重塑、調(diào)控氣道上皮細(xì)胞功能、改善氣道上皮細(xì)胞對(duì)損傷和修復(fù)、緩解哮喘氣道炎癥。

最后，分子對(duì)接結(jié)果顯示，木犀草素、隱丹參酮和丹參酮ⅡA與Akt1、EGFR 等關(guān)鍵靶點(diǎn)之間有較好的結(jié)合力，提示丹參重要活性成分與疾病靶點(diǎn)生物親和力強(qiáng)，在哮喘治療方面具有潛在的藥理活性。

4 結(jié)論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法構(gòu)建丹參治療哮喘的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，提示丹參通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的方式治療哮喘，并基于分子對(duì)接初步模擬其可能的分子作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參59 個(gè)潛在的有效成分通過(guò)108 個(gè)靶點(diǎn)、20 條主要通路發(fā)揮治療哮喘的作用。其中3 個(gè)重要化合物通過(guò)與10 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)相互作用，介導(dǎo)3 條重要通路在治療哮喘中發(fā)揮重要作用。隱丹參酮通過(guò)作用于TNF、TLR4 等靶點(diǎn)介導(dǎo)NF-κB 通路，減輕哮喘氣道炎癥；丹參酮ⅡA主要通過(guò)NFKBIA 等抑制TNF-α和NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB 通路，減輕炎癥損傷和治療哮喘；木犀草素主要通過(guò)Akt1、IL-6 和STAT3 等靶點(diǎn)影響PI3K-Akt和JAK-STAT 通路，緩解氣道炎癥、改善氣道重塑和免疫調(diào)節(jié)來(lái)治療哮喘。最后通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證三者與疾病靶點(diǎn)生物親和力高，具有良好的藥效活性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。