王艷莉，姚寶輝，譚宇塵，康宇坤，張德罡，蘇軍虎

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)-新西蘭梅西大學(xué)草地生物多樣性研究中心，甘肅 蘭州 730070)

陰道涂片法是指對(duì)陰道脫落物進(jìn)行顯微鏡涂片檢查的一種方法，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物發(fā)情周期鑒定及其病理組織學(xué)檢測(cè)，陰道涂片通常有刮取法和吸取法。刮取法即用玻璃棒或棉簽在陰道內(nèi)壁輕輕刮一下，把玻璃棒或棉簽在載玻片上涂勻干燥后進(jìn)行染色，然后在顯微鏡下觀察。吸取法即用細(xì)長(zhǎng)的吸管或移液槍深入陰道后宮隆處吸取排液，制片染色[1]。因陰道上皮細(xì)胞受激素的影響發(fā)生周期性的變化，利用陰道細(xì)胞涂片檢查能比較確切地反映體內(nèi)性激素水平及其對(duì)陰道上皮的影響，進(jìn)而反映動(dòng)物發(fā)情狀態(tài)[2]。陰道涂片法具有簡(jiǎn)單、高效、基本無(wú)痛苦且經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，它是鑒別動(dòng)物發(fā)情常用的一種檢查方法。目前陰道涂片的染色方法主要有HE染色[3]、快速革蘭氏染色[4]、吉姆薩染色[5]、瑞氏染色[6]、巴氏染色法[6]及其改良染色法等。巴氏染色法步驟較繁雜，快速革蘭氏染色雖然步驟簡(jiǎn)單，易操作，但辨認(rèn)細(xì)胞需要一定的經(jīng)驗(yàn)。吉姆薩染色時(shí)間較長(zhǎng)，雜質(zhì)易被染色，導(dǎo)致背景雜亂暗淡，細(xì)胞形態(tài)不鮮明，清晰度差[5]。HE染色法操作簡(jiǎn)易便捷，可快速觀察鑒定動(dòng)物的陰道上皮細(xì)胞，是目前動(dòng)物發(fā)情周期常用的染色方法，在不同的動(dòng)物上，該方法也有一定的適用性[3]。肖小芹等研究表明實(shí)驗(yàn)樣本量大，判斷小鼠動(dòng)情周期時(shí)，瑞氏染色法更適用；但樣本量小，只檢測(cè)小鼠陰道脫落細(xì)胞形態(tài)等時(shí)，巴氏染色法效果更好[7]。也有研究報(bào)道，大鼠陰道涂片大規(guī)模檢查時(shí)，呂氏堿性美籃染色法應(yīng)用效果顯著[8]。檢驗(yàn)這些方法在不同物種上的適用性，對(duì)物種進(jìn)一步的研究能提供基礎(chǔ)參考。

高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)隸屬于嚙齒目(Rodentia)，鼴形鼠科(Spalacidae)，鼢鼠亞科(Myospalactinae)，凸顱鼢鼠屬(Eospalax)[9]，是青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種[10]。在人為和自然因素的影響下，鼠害增加，高寒草甸退化加劇[14]。因此，許多研究集中于尋找降低高原鼢鼠種群密度的防治措施[12]，但其在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中所具有的獨(dú)特功能和地位不容忽視，有關(guān)其數(shù)量的管理是關(guān)鍵[14]。而掌握高原鼢鼠的繁殖規(guī)律是控制其種群數(shù)量的有效途徑[15]。孫儒泳等研究表明，高原鼢鼠雌性一般以懷孕率、胎仔數(shù)、妊娠率等為繁殖指標(biāo)，而雄性的繁殖指標(biāo)一般有平均精巢長(zhǎng)(或重量)和儲(chǔ)精囊及其睪丸、附睪的形態(tài)變化等[16]。其繁殖周期是從3月底到6月，繁殖周期因氣候條件不同而有所不同[17]。高原鼢鼠常年?duì)I地下生活[21]，其繁殖和儲(chǔ)糧行為皆在地下通道完成[18]，難以直接觀察且抓捕困難。鑒于此，陰道細(xì)胞涂片法結(jié)合外陰觀察更適用于高原鼢鼠發(fā)情周期的鑒定，且在其他哺乳動(dòng)物和小型嚙齒動(dòng)物上已有應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外已通過(guò)陰道細(xì)胞涂片法確定了豚鼠(Caviaporcellus)[20]、小鼠(Musmusculus)[21]和子午沙鼠(Merionesmeridianus)[22]等的發(fā)情周期。高質(zhì)量的陰道涂片檢查是準(zhǔn)確確定發(fā)情周期的前提條件，而適宜的染色方法是高質(zhì)量陰道涂片的重要保障[5]。高原鼢鼠陰道涂片應(yīng)用尚不成熟，陰道涂片法判斷發(fā)情周期也處于探索階段，為此嘗試多種涂片染色方法。本研究通過(guò)野外非損傷活捕，室內(nèi)飼養(yǎng)的方法，進(jìn)行了發(fā)情周期陰道涂片染色方法的篩選。選用瑞氏、HE和快速革蘭氏3種染色方法，通過(guò)比較3種染色方法的陰道細(xì)胞涂片效果，旨在為陰道涂片法判斷高原鼢鼠發(fā)情周期提供一個(gè)簡(jiǎn)單、高效的染色方法，以期為高原鼢鼠發(fā)情周期的鑒定及其繁殖生物學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為野外防治時(shí)機(jī)和方法的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

于2020年5月，在甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鎮(zhèn)用籠捕法隨機(jī)抓捕生長(zhǎng)發(fā)育正常的高原鼢鼠，稱重后按體重來(lái)鑒別年齡[23]，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，初步判斷懷孕等狀況[24]，選取性成熟且健康未孕的雌性高原鼢鼠45只，體重147.54～217.75 g/只，平均(164.13±3.02)g/只，利用本實(shí)驗(yàn)室的方法單獨(dú)飼養(yǎng)于(20×33×25)cm3的收納箱中，取其生活洞道土為墊料，以其喜食食物紅薯(Ipomoeabatatas)等喂養(yǎng)[25]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組15只，每天8∶00，18∶00對(duì)3組高原鼢鼠分別使用自制棉簽制作陰道涂片。固定高原鼢鼠時(shí)一只手固定其頭部，另一只手抓住尾巴固定后腳使其露出陰道口，先用生理鹽水濕潤(rùn)過(guò)的無(wú)菌棉簽擦拭陰道口，將蘸濕的棉簽插入高原鼢鼠陰道內(nèi)0.5～1 cm，輕柔旋轉(zhuǎn)1～2圈，將棉簽均勻涂在事先滴有生理鹽水的干凈載玻片上，連續(xù)20 d。涂片自然風(fēng)干后滴加甲醇固定10 min。涂片固定好后，分別進(jìn)行染色。

1.2.1 HE染色 蘇木精染色液中染色5 min，流水沖洗，鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗返藍(lán)，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡檢，觀察細(xì)胞的形態(tài)及著色[2]。

1.2.2 瑞氏染色 滴加數(shù)滴瑞氏染液(染液多少根據(jù)涂片面積調(diào)整)，瑞化1～3 min(為防止染液干涸，可縮短瑞化時(shí)間或及時(shí)添加染液)；按比例配制的KH2PO4、Na2HPO4緩沖液(pH=7.0)加染液量的1.5倍，二者混勻等10 min；流水沖洗(玻片平放，水流應(yīng)緩)，二甲苯透明，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡鏡檢，觀察細(xì)胞的形態(tài)及著色。

1.2.3 快速革蘭氏染色 快速革蘭氏染色初染，滴加50 μL龍膽紫液(龍膽紫和乙醇)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗；媒染，滴加50 μL碘溶液(碘和碘化鉀)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗；脫色，滴加50 μL脫色液(乙醇)在涂片上進(jìn)行脫色，靜置10 s，蒸餾水沖洗；復(fù)染，滴加50 μL沙黃溶液(沙黃和乙醇)在涂片上，靜置10 s，蒸餾水沖洗，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡鏡檢，觀察細(xì)胞的形態(tài)及著色[4]。

1.3 陰道細(xì)胞涂片鏡檢及數(shù)據(jù)分析

對(duì)陰道細(xì)胞涂片用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鏡檢。白細(xì)胞，一般呈圓形或卵圓形，胞核、胞質(zhì)分界不明顯，胞體邊界清晰，且小于上皮細(xì)胞；上皮細(xì)胞，直徑20～70 μm，大多呈圓形、四邊形或菱形，輪廓清晰，核濃縮，核質(zhì)分形明顯；角化上皮細(xì)胞，一般呈多邊形且邊緣不規(guī)則，未完全角化上皮細(xì)胞核變小，核膜界限模糊，核質(zhì)著色深淺因細(xì)胞角化程度不同而有明顯差別，完全角化上皮細(xì)胞是視野中最大的細(xì)胞，細(xì)胞核角化，隨著角化程度的不同細(xì)胞形態(tài)略有差別。根據(jù)陰道細(xì)胞特點(diǎn)區(qū)分不同染色方法下不同細(xì)胞類(lèi)型的著色情況，同時(shí)記錄結(jié)果、照相。各染色方法間的檢出率采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，以P<0.01為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

高原鼢鼠的發(fā)情周期包括4個(gè)階段：發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和發(fā)情間期。在發(fā)情前期上皮細(xì)胞和白細(xì)胞占主導(dǎo)地位，在發(fā)情期和發(fā)情后期3類(lèi)細(xì)胞并存，即上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和角質(zhì)化上皮細(xì)胞；角質(zhì)化上皮細(xì)胞則主要分布在發(fā)情期；發(fā)情后期角質(zhì)化上皮細(xì)胞逐漸減少，以上皮細(xì)胞為主；發(fā)情間期陰道涂片上為大量白細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞?，F(xiàn)將用3種不同染色方法的陰道涂片鏡檢結(jié)果簡(jiǎn)要敘述如下：

2.1 HE染色

HE染色過(guò)程中陰道細(xì)胞核經(jīng)蘇木精染色呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)紫色，角質(zhì)化上皮細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)、嗜伊紅顆粒等經(jīng)伊紅染色呈現(xiàn)不同程度的紅色，白細(xì)胞核為深藍(lán)紫色，胞漿著色淡，分界不明顯，分葉核較明顯。發(fā)情前期，陰道涂片上以有核上皮細(xì)胞為主，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染色較淡，呈淡粉色，透明度高(圖1-A)；發(fā)情期，幾乎都是無(wú)核角化上皮細(xì)胞，胞質(zhì)染成粉色、胞核呈深藍(lán)紫色或粉色，細(xì)胞質(zhì)由核至邊緣區(qū)著色逐漸變淺，呈簇狀、塊狀和串狀(圖1-B)；發(fā)情后期，陰道涂片可見(jiàn)大量白細(xì)胞和少量完全和未完全角化上皮細(xì)胞(圖1-C)；發(fā)情間期陰道涂片上為大量白細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞。(圖1-D)；各時(shí)期圖片背景清晰無(wú)雜質(zhì)。

圖1 高原鼢鼠發(fā)情周期陰道涂片HE染色結(jié)果(400×)Fig.1 HE staining results of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)注：A，發(fā)情前期；B，發(fā)情期；C，發(fā)情后期；D，發(fā)情間期；藍(lán)色三角表示上皮細(xì)胞；黑色三角表示完全角化細(xì)胞；綠色表示未完全角化細(xì)胞；紅色三角表示白細(xì)胞,下同

2.2 瑞氏染色

瑞氏染色過(guò)程中，陰道涂片細(xì)胞核經(jīng)瑞氏染液被染成深藍(lán)紫色，角化上皮細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)等被染成不同程度的淺藍(lán)紫色，白細(xì)胞分葉核不易觀察到。發(fā)情前期，白細(xì)胞核呈深藍(lán)紫色，細(xì)胞輪廓清晰可見(jiàn)，核質(zhì)分型不明顯(圖2-A)；發(fā)情期，角化的上皮細(xì)胞被染成淺藍(lán)紫色(圖2-B)；發(fā)情后期，未完全角化的上皮細(xì)胞可見(jiàn)核被染成深藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)及完全角化細(xì)胞被染成淺藍(lán)紫色(圖2-C)；發(fā)情間期，可見(jiàn)白細(xì)胞、核上皮細(xì)胞藍(lán)色淡染，核質(zhì)分型不明顯(圖2-D)。

圖2 高原鼢鼠發(fā)情周期陰道涂片瑞氏染色結(jié)果(400×)Fig.2 Wright staining of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)

2.3 快速革蘭氏染色

快速革蘭氏染色過(guò)程中細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)經(jīng)初染、媒染、脫色、復(fù)染4步分別呈紫紅色、玫紅色，白細(xì)胞則被染成深紅色。發(fā)情前期，陰道涂片以上皮細(xì)胞為主，一般呈圓形或橢圓形分布，其細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)分別被染成紫紅色和玫紅色，細(xì)胞輪廓較清晰，同時(shí)存在玫紅色的無(wú)核角化上皮細(xì)胞(圖3-A)；發(fā)情期，陰道涂片中滿視野為形態(tài)不規(guī)則多邊形的無(wú)核角化上皮細(xì)胞，其被染成玫紅色分布在涂片上(圖3-B)；發(fā)情后期，少量無(wú)核角化上皮細(xì)胞，細(xì)胞核輪廓較清晰，細(xì)胞膜完整，整體層次感明顯且易于區(qū)分，白細(xì)胞以卵圓形分布，呈深紅色，細(xì)胞形態(tài)清晰(圖3-C)；發(fā)情間期，以白細(xì)胞為主，有核細(xì)胞和無(wú)核角化上皮細(xì)胞極少量存在(圖3-D)。

圖3 高原鼢鼠發(fā)情周期陰道涂片快速革蘭氏染色結(jié)果(400×)Fig.3 Rapid Gram staining of vaginal smears of plateau zokor during estrus cycle (400×)

2.4 高原鼢鼠3種染色方法檢出率的比較

陰道涂片的檢出率是指陰道涂片鏡檢時(shí)背景清晰，各類(lèi)細(xì)胞可見(jiàn)且易區(qū)分的涂片與總涂片數(shù)的比率。采用HE染色的陰道涂片檢出率為90.67%，對(duì)陰道涂片細(xì)胞的檢出率顯著高于瑞氏染色和快速革蘭氏染色方法(P<0.01)；采用瑞氏染色的陰道涂片檢出率為58.00%，采用快速革蘭氏染色的陰道涂片檢出率為67.30%，瑞氏和快速革蘭氏兩種染色方法對(duì)于陰道涂片的檢出判斷無(wú)明顯差別(P<0.01)(表1)。

表1 高原鼢鼠陰道涂片3種染色方法檢出率的比較

3 討論

通過(guò)染色、鏡檢分析，就染色過(guò)程而言，HE染色法步驟簡(jiǎn)單易操作，且省料省能，但耗時(shí)較長(zhǎng)，單片染色需20～23 min，所以提倡批量染色；瑞氏染色法瑞化時(shí)間較難控制，易染色過(guò)度，耗費(fèi)人力物力，對(duì)操作要求較高，但單片耗時(shí)少，15 min左右；快速革蘭氏染色法初染、媒染、復(fù)染過(guò)程中染液量不易控制，易造成染色過(guò)度，整個(gè)過(guò)程單片耗時(shí)13～15 min，對(duì)操作人員要求高。從染色效果比較，HE染色根據(jù)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對(duì)蘇木精染液和伊紅染液的親嗜性不同，染成易于區(qū)分的藍(lán)紫色和粉紅色，細(xì)胞分型明顯，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色分明，易操作，出現(xiàn)誤差較小，成功率高，著色均勻且涂片檢出率與其他兩種方法具有顯著差異(P<0.01)；瑞氏染色法中根據(jù)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對(duì)瑞氏染液的親嗜性的不同，核質(zhì)被染成深淺不一的藍(lán)紫色，快速革蘭氏染色法包括初染、媒染、脫色和復(fù)染4個(gè)步驟使得細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)不同程度的紅色；但3種染色方法鑒別結(jié)果基本一致。從染色背景而言，HE染色下的陰道涂片背景清晰、干凈，透明度高，利于觀察判斷，可進(jìn)行批量染色；瑞氏背景雜亂，個(gè)別雜質(zhì)相對(duì)較多，易造成細(xì)胞疊加，染色加深不易觀察判斷；快速革蘭氏染色背景相對(duì)暗淡、雜亂，核質(zhì)區(qū)分不分明，不易觀察。

目前，用于檢查陰道涂片的方法有很多，大多數(shù)研究都采用HE染色法[21]，HE染色法染液配置方法簡(jiǎn)單易操作，染色過(guò)程要求低，染色效果好、易觀察；部分研究中使用瑞氏染色[26]，但是瑞氏染液條件要求苛刻，按比例配制的KH2PO4、Na2HPO4緩沖液的pH不穩(wěn)定，會(huì)造成一定的誤差，核質(zhì)著色顏色相近不易區(qū)分，而且有時(shí)難以著色；快速革蘭氏在檢查陰道涂片中的應(yīng)用不多[24]，其操作條件不好控制，初染、復(fù)染過(guò)程中易出現(xiàn)沖洗不夠或沖洗過(guò)度的情況；所以，大規(guī)模檢查高原鼢鼠陰道涂片時(shí)，采用HE染色法效率更高。通過(guò)對(duì)3種染色的比較，發(fā)現(xiàn)使用HE染色能夠準(zhǔn)確、高效的篩選出處于發(fā)情周期的高原鼢鼠陰道涂片，因此建議在檢查大批量陰道涂片確定高原鼢鼠發(fā)情周期時(shí)使用HE染色。另外，在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了一些值得注意的問(wèn)題，在取陰道分泌物時(shí)動(dòng)作要輕緩，使用牙簽制作的小棉簽是為了比較容易進(jìn)入高原鼢鼠的陰道，雖然削去了尖端但還是會(huì)有殘留且易刮傷試驗(yàn)鼠陰道上皮。在進(jìn)行染色前，一定要保證甲醇固定好且已自然風(fēng)干；HE染色時(shí)酒精梯度時(shí)間可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)減少。瑞氏染色時(shí)緩沖液的pH不能偏酸或偏堿，否則會(huì)影響染色效果；快速革蘭氏染色時(shí)傾倒玻片上染液時(shí)要快，否則會(huì)造成染色不均，要用蒸餾水進(jìn)行沖洗，用自來(lái)水沖洗會(huì)使涂片背景雜質(zhì)增多。

4 結(jié)論

高原鼢鼠繁殖期用陰道涂片法判斷其發(fā)情周期時(shí)，HE染色后涂片背景及細(xì)胞分型清晰，核質(zhì)著色差異明顯且檢出率高；瑞氏染色核質(zhì)呈不同程度的藍(lán)紫色，背景雜亂，核質(zhì)染色差別不明顯；快速革蘭氏染色將細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)分別染成紫紅色和玫紅色，背景相對(duì)暗淡，白細(xì)胞則染成深紅色，核質(zhì)著色不易區(qū)分，影響觀察效果。綜合分析，HE陰道涂片染色更能準(zhǔn)確、高效地鑒別出高原鼢鼠的發(fā)情周期。