黃 歡，郭月英，張 敏，張 月，要 鐸，蘇 琳，薩仁圖亞，劉培清，靳 燁,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.烏拉特中旗農(nóng)牧和科技局，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015300；3.烏蘭察布市市場監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000）

衡量肉品質(zhì)優(yōu)劣的指標包括肉的色澤、嫩度、風味、肌內(nèi)脂肪含量等。隨著生活水平的不斷提高，消費者對飲食健康也越來越重視，具有良好感官品質(zhì)和功能特性的健康肉類受到了廣泛的關注。動物脂肪組織作為三大營養(yǎng)素之一，是機體主要的儲能物質(zhì)，也是肉類重要的風味前體物質(zhì)[1]。機體的脂肪代謝包括脂肪分解、脂肪合成和類脂的代謝，畜禽脂肪沉積與脂肪代謝關系密切。脂肪代謝紊亂會導致畜禽生長性能下降，肉品質(zhì)降低[2]。

我國是羊肉的生產(chǎn)大國，羊肉作為人們主要食用的肉類之一，是人體攝取優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和必需脂肪酸的重要食品來源。傳統(tǒng)羊的養(yǎng)殖方式為放牧飼養(yǎng)，然而該方式易對生態(tài)環(huán)境造成破壞，因此國家開始相應采取限牧政策，隨著限牧政策的實施開展，不少研究表明飼養(yǎng)方式的改變增加了羊的屠宰性能卻降低了其營養(yǎng)和食用品質(zhì)[3]。本課題組先前的研究表明，與舍飼羊肉相比，放牧羊肉具有較高的營養(yǎng)價值和食用價值[4]。王宇研究發(fā)現(xiàn)舍飼有利于肌外脂肪的沉積，放牧飼養(yǎng)有利于肌內(nèi)脂肪的沉積[5]。

為了改善這一現(xiàn)狀，近年來人們做了很多關于營養(yǎng)因素和不同飼養(yǎng)方式對畜產(chǎn)品品質(zhì)影響的研究，但在當下集約化畜牧生產(chǎn)過程中關于運動因素對羊肉品質(zhì)影響的研究卻很少。每天進行適宜的運動可以提高動物脂肪代謝水平，調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡；而運動不足會導致動物抗病力、耐受各種應激能力和其他生長性能指標水平下降；還會間接影響動物的生長發(fā)育和繁殖力[6]。楊毅等發(fā)現(xiàn)耐力運動能夠使脂滴水解酶活力上調(diào)，促使骨骼肌中的脂滴水解，降低了脂肪在骨骼肌中的沉積[7]。Gangnat等研究表明運動會影響牛的新陳代謝，使得肌纖維類型發(fā)生改變，進而影響牛肉品質(zhì)[8]。因此本實驗通過對蘇尼特羊進行驅(qū)趕運動訓練，探究運動因素影響蘇尼特羊脂肪代謝和肉品質(zhì)的內(nèi)在機制，以期為之后通過脂肪代謝改善蘇尼特羊肉品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

選取生長在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗哈拉圖蘇木牧區(qū)的12 只蘇尼特羊（3 月齡，體況良好），平均體質(zhì)量為（20.22±0.68）kg，公母各半。

氫氧化鈉、體積分數(shù)75%乙醇、三氟化硼-乙醚絡合物國藥集團化學試劑有限公司；甲醇 山東西亞化學股份有限公司；三氯甲烷 北京化工廠；異丙醇 上海振興化工二廠有限公司；正己烷（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒。

1.2 儀器與設備

pH-STAR型胴體直測式pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司；TCP2全自動測色色差計 北京奧依克光電儀器有限公司；C-LM3B嫩度儀 北京天翔飛域國際有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 運動實驗設計與分組

運動實驗設計如圖1所示，12 只蘇尼特羊隨機分為對照組和運動組，每組6 只，公母各半。對照組和運動組在相同的圈中集中飼養(yǎng)，運動組每日趕至運動場內(nèi)進行驅(qū)趕運動：在18.5 m×10.5 m的羊圈中上下午各進行驅(qū)趕運動30～40 min，步數(shù)10 000 步以上，運動距離約為6 km。兩組飲食均以青貯飼料、精飼料、玉米為主，自由飲水。預實驗期7 d，實驗期90 d。

圖1 運動實驗設計（n＝6）Fig. 1 Exercise experimental design (n = 6)

1.3.2 屠宰性能的測定

屠宰前禁食24 h、禁飲水2 h，稱質(zhì)量（活體質(zhì)量）。宰后45 min內(nèi)剪取5 g背最長肌置于凍存管中，迅速放入液氮罐中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存；取背最長肌約50 g，于-20 ℃下保存?zhèn)溆?。宰后按照GB/T 9961—2008《鮮、凍胴體羊肉》進行胴體分割，同時測定胴體質(zhì)量、胴體深、胴體長、眼肌面積指標，并按式（1）計算屠宰率[9-10]。

1.3.3 羊肉pH值、色澤、嫩度、蒸煮損失率的測定

羊屠宰后取其背最長肌，使用pH-STAR型胴體直測式pH計分別測得的最初pH值（pH45min）；靜置排酸24 h后測得的pH值記為pH24h，使用TCP2全自動測色色差計測定樣品色澤，L*值表示亮度，b*值表示黃藍度，a*值表示紅綠度。采用C-LM3B型嫩度儀用于嫩度的測定。根據(jù)GB/T 9695.7—2008《肉與肉制品 總脂肪含量測定》采用索氏抽提法測定肌內(nèi)脂肪含量。將背最長肌切為2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉塊放置在密封袋中，在75 ℃水浴鍋中煮制45 min，取出冷卻至室溫，按式（2）計算蒸煮損失率。

式中：m1為肌肉塊初始質(zhì)量/kg；m2為肌肉塊煮制冷卻后質(zhì)量/kg。

1.3.4 脂肪酸相對含量測定

將1.3.1節(jié)得到的背最長肌解凍，剔除筋膜剁碎后，按照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》提取肌肉脂肪酸，參照參考文獻[11]制備脂肪酸甲酯后用氣相色譜聯(lián)用儀分析。使用Rt-2560石英毛細管色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）。程序升溫分兩步：溫度由60 ℃升高至120 ℃，速率為30 ℃/min，穩(wěn)定5 min后繼續(xù)將溫度提高至250 ℃，速率為5 ℃/min，穩(wěn)定25 min后結(jié)束升溫。離子源溫度和傳輸線溫度分別為250 ℃和280 ℃。樣品中脂肪酸根據(jù)37 種脂肪酸混合標準品來定性，參考GB 5009.168—2016測定背最長肌中的脂肪酸相對含量。

1.3.5 脂肪代謝調(diào)控基因相對表達量的測定

參照文獻[5]進行蘇尼特羊背最長肌RNA的提取并測定脂肪代謝相關調(diào)控基因（過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）、過氧物酶體增殖激活受體γ輔激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator，PGC）-1α、鋅指蛋白正調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域蛋白16（positive regulatory domain containing 16，PRDM16）和解偶聯(lián)蛋白-1（uncoupling protein-1，UCP-1））相對表達量。使用微量分光光度計測定cDNA濃度后將RNA置于-80 ℃冰箱保存。將提取好的RNA樣品稀釋成質(zhì)量濃度500 ng/μL的溶液，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行RNA的反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。引物如表1所示，均由上海生工生物工程有限公司設計并合成，其中18S rRNA為管家基因。PCR定量方法參考文獻[11]，反應體系擴增條件參考文獻[9]。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time fluorescent quantitativePCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果用平均值±標準差表示，使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 運動對蘇尼特羊屠宰性能的影響

畜禽的屠宰性能可以反映其產(chǎn)肉性能，同時也可以衡量養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。由表2可知，運動組的活體質(zhì)量、背膘厚度都顯著低于對照組（P＜0.05），兩組的胴體質(zhì)量、胴體高度、胴體深度、眼肌面積均無顯著性差異（P＞0.05）。其中背膘厚度是胴體脂肪含量的標志，運動是促進脂肪分解的主要途徑，林誠等研究發(fā)現(xiàn)運動可以降低大鼠的體質(zhì)量和脂肪含量[12]，這與本研究的結(jié)果相似，可能是因為運動增加了機體的脂質(zhì)代謝能力，通過調(diào)節(jié)脂肪細胞因子、相關調(diào)控基因促進更多脂肪分解為機體提供能量，脂肪分解代謝的增加減少了脂肪沉積。

表2 運動對蘇尼特羊屠宰性能的影響（n＝6）Table 2 Effect of exercise on slaughter performance of Sunit sheep (n = 6)

2.2 運動對蘇尼特羊肉品質(zhì)的影響

肌肉的pH值可以反映動物宰后肌肉糖原酵解速率，pH值會影響肉色、嫩度等多個肉品質(zhì)評價指標[13]。由表3可知，兩組初始pH值并無顯著性差異（P＞0.05），排酸24 h后的運動組pH值顯著高于對照組（P＜0.05），這是因為肌肉中糖原發(fā)生無氧酵解時，乳酸水平不同程度的升高，乳酸電離產(chǎn)生的H+改變了肌細胞pH值[14]。肌肉的嫩度通常用剪切力來表示，與肌內(nèi)脂肪含量存在著一定的相關性。肌內(nèi)脂肪沉積在肌外膜、肌束膜，可以疏松結(jié)締組織，從而提高肌肉嫩度[15]。對照組肌內(nèi)脂肪含量高于運動組（P＜0.05），嫩度顯著低于運動組（P＜0.05）。Marcus等發(fā)現(xiàn)12 周的運動會降低人體肌內(nèi)脂肪的含量[16]。Gangnat等發(fā)現(xiàn)加強運動使肌纖維類型發(fā)生改變，導致牛肉嫩度變差[8]。Jiang等發(fā)現(xiàn)運動會減少機體脂肪的沉積[17]，這與本研究結(jié)果相似。肉色是影響消費者選擇畜產(chǎn)品的重要因素，有研究表明運動對肉色有潛在影響[18]，對照組亮度L*值、紅度a*值、黃度b*值均顯著高于運動組（P＜0.05），說明運動組肉色亮度降低，這與Vestergaard等研究結(jié)果[19]相似。肉色會受到pH值下降速率和程度的影響，肌肉pH值較高與氧化代謝、較高的血紅素色素含量和較深的顏色有關，對照組排酸后pH值比運動組下降更快，這可能導致運動組紅度低[20]。畜禽肉品質(zhì)中保水性會直接影響肉的營養(yǎng)成分、嫩度和色澤等指標，由表3可知，對照組蒸煮損失率高于運動組，但兩組之間并無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 運動對蘇尼特羊肉品質(zhì)的影響（n＝6）Table 3 Effect of exercise on meat quality of Sunit sheep (n = 6)

2.3 運動對蘇尼特羊脂肪酸組成的影響

脂肪酸組成不僅影響肉的營養(yǎng)價值，還與肌肉的氧化穩(wěn)定性有關，進而會影響其風味和肌肉顏色。耐力運動會增加骨骼肌的能量需求，其能量底物來源主要是從血液循環(huán)中攝取和源自脂肪脂解的非酯化脂肪酸，參與脂肪代謝的過程中，大部分脂肪酸被消耗，僅有少部分轉(zhuǎn)化為肌內(nèi)脂肪。而反芻動物脂肪酸組成主要取決于瘤胃中的脂肪代謝[20]。由表4可知，蘇尼特羊背最長肌中飽和脂肪酸主要以棕櫚酸和硬脂酸為主，其中硬脂酸含量過高會加重羊肉的膻味[21]，實驗結(jié)果顯示運動組月桂酸相對含量顯著增加，花生酸的相對含量顯著降低（P＜0.05），其他飽和脂肪酸相對含量并無顯著差異（P＞0.05）。反芻動物的長鏈飽和脂肪酸合成主要與瘤胃微生物氫化有關，飽和脂肪酸攝入過多會增加血液中膽固醇的含量，從而增加其他代謝類疾病的患病風險[22]。

表4 運動對蘇尼特羊背最長肌中脂肪酸的影響Table 4 Effect of exercise on fatty acid composition in Longissimus dorsi muscle of Sunit sheep

羊肉中富含多種人體所需的不飽和脂肪酸。如表4所示，與對照組相比，運動組蘇尼特羊背最長肌中油酸（C18:1）相對含量更低，且差異顯著（P＜0.05）。油酸是蘇尼特羊背最長肌中主要單不飽和脂肪酸，研究表明C18:1可以降低血液中膽固醇含量，對健康有益[23]。馬惠茹等發(fā)現(xiàn)肉中飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量高，則肉的嫩度、多汁性和風味都較好，但肌肉中飽和脂肪酸含量過高攝入后于人體健康無益[24]。實驗結(jié)果表明對照組反式亞油酸相對含量顯著高于運動組（P＜0.05）。食物加工過程中的反式亞油酸可能會誘發(fā)人體患上心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病等多種疾病，而天然食物來源的反式亞油酸進入人體后危害較小。與對照組相比，運動組C20:3、C20:4相對含量均顯著降低（P＜0.05）。二十碳五烯酸相對含量降低，但并無顯著性差異（P＞0.05）。二十碳五烯酸有助于降低血液中膽固醇和甘油三酯的含量，可以促進體內(nèi)飽和脂肪酸代謝。陳鑫等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過運動場放養(yǎng)的雞肉色澤、pH值、脂肪酸組成均有改善[25]，可能由于運動增加骨骼肌中脂肪酸代謝能力，經(jīng)過一系列脂代謝酶和腎上腺素等細胞因子的調(diào)節(jié)，機體內(nèi)甘油三酯在一系列細胞因子的調(diào)節(jié)下參與β氧化，釋放能量為機體供能[26]。這與本研究不一致，可能原因是本實驗中運動消耗營養(yǎng)未能及時補充[27]，減少了不飽和脂肪酸的沉積。目前人們認為理想多不飽和脂肪酸的攝入n-6與n-3的比例應為4∶1～10∶1之間[28]，運動組n-3多不飽和脂肪酸相對含量顯著低于對照組（P＜0.05），n-6/n-3與對照組相比并無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 運動對蘇尼特羊脂肪代謝調(diào)控基因相對表達量的影響

動物的脂肪代謝是一個復雜且精密的過程，由眾多基因參與并維持機體的能量代謝平衡和穩(wěn)態(tài)。由圖2可知，與對照組相比，運動組HSL、FASN、PRDM16、UCP-1相對表達量均顯著升高（P＜0.05），基因PPARγ、PGC-1α相對表達量無顯著性差異（P＞0.05）。其中PPARγ是調(diào)控脂肪代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)脂肪細胞的增殖分化和一系列脂肪代謝特異性基因的表達，因此處于脂肪沉積信號傳遞的核心位置[29]。Guo等發(fā)現(xiàn)減少日糧中蛋白質(zhì)供能水平使PPARγ基因被激活，增加了肌肉中的脂肪含量[30]。這與本研究結(jié)果不同，可能的原因為PPARγ激活了下游PGC-1α，其作為PPARγ轉(zhuǎn)錄協(xié)同激活因子參與調(diào)控能量代謝相關多種功能，可介導線粒體生物發(fā)生增加機體的氧化代謝能力，致使脂肪沉積減少[31]。有研究顯示，長期有氧運動和急性運動都可以增加骨骼肌PGC-1α的表達[32]，本研究中運動組PGC-1α基因相對表達量高于對照組，但并無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 運動對蘇尼特羊肉脂肪代謝相關調(diào)控基因相對表達量的影響（n＝ 6）Fig. 2 Effect of exercise on relative expression levels of lipid metabolism-related genes in lamb meat from Sunit sheep (n = 6)

PPARγ還可調(diào)控其靶基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)ASN）基因含量，影響動物的脂肪合成過程；而激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglyceride lipase，HSL）是參與脂質(zhì)分解過程中的關鍵酶，是動物脂質(zhì)沉積相關的候選基因。張海波等研究發(fā)現(xiàn)促進脂肪合成相關基因FASN、PPARγ等的表達，同時抑制脂肪分解相關基因HSL的表達，有利于提高肌內(nèi)脂肪的沉積，增加肉的嫩度[33]。魏建翔等發(fā)現(xiàn)中等強度運動能夠更顯著的激活骨骼肌組織內(nèi)脂肪水解酶HSL活性，從而減少骨骼肌中脂肪的異位沉積[34]。這與本研究結(jié)果相似，由圖2可知，運動增加了FASN和HSL的相對表達量，表明運動增加了機體的整體脂肪代謝水平，加快了機體的能量代謝，可能是由于運動后未能及時補充能量，因此減少了脂肪的沉積，肌內(nèi)脂肪含量也減少從而導致肉的嫩度變差。

機體的脂肪組織依據(jù)功能不同可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，其中白色脂肪主要功能是能量儲存，而棕色脂肪可調(diào)節(jié)能量代謝[35]。白色脂肪是成年動物的脂肪組成的主要形式，在交感神經(jīng)興奮時（冷刺激、運動），部分白色脂肪細胞內(nèi)線粒體數(shù)目增加，氧化代謝加快，此時發(fā)生的一系列變化又被稱為白色脂肪的“棕色化”[36]。因此運動增加機體脂質(zhì)代謝的原因一方面可能是增加脂質(zhì)代謝酶活基因的表達；另一方面可能是因為運動促進了部分白色脂肪“棕色化”[37]。其中PRDM16是控制棕色脂肪組織分化的分子開關[38]，UCP-1是存在于棕色脂肪細胞線粒體內(nèi)膜上介導非顫抖性產(chǎn)熱的特異性蛋白。Klaus等對脂肪細胞研究發(fā)現(xiàn)，如果在脂肪細胞分化之前引入PRDM16時，存在于全脂肪組織中的白色脂肪細胞前體可以有效地轉(zhuǎn)化為棕色脂肪樣表型[39]。本實驗結(jié)果顯示運動組的PRDM16和UCP-1基因相對表達量顯著提高（P＜0.05），表明運動可能通過激活PRDM16，促使部分白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化，線粒體數(shù)量急劇增加，增加了PGC-1α和UCP-1的表達，線粒體發(fā)生增加能量代謝加快，致使體質(zhì)量和脂肪含量降低。還有研究表明機體劇烈運動時肌肉內(nèi)會發(fā)生無氧呼吸，此時代謝產(chǎn)物為乳酸，乳酸可以誘導鼠中白色脂肪褐變，進一步提高能量代謝水平[40]。

綜上所述，運動組脂肪代謝相關調(diào)控基因相對表達量都有所升高，表明運動增加了機體整體的脂肪代謝水平。動物體質(zhì)量降低，肌內(nèi)脂肪沉積減少，一方面可能是由于運動增加了機體能量消耗未能及時補充，另一方面可能是運動促進白色脂肪“棕色化”，促進了線粒體生物發(fā)生，脂肪酸β氧化增加使得脂肪含量降低。

2.5 脂肪酸相對含量與脂肪酸相關調(diào)控基因表達量相關性分析結(jié)果

脂肪酸沉積過程實質(zhì)上是脂肪酸酯化為甘油三酯并沉積為體脂的過程，脂肪酸通過氧化反應參與機體能量代謝，整個過程中受到多種基因的調(diào)控[41]。盡管不飽和脂肪酸攝入對人體有益，但肉中含量過多會導致氧化酸敗，從而影響風味。由表5可知，HSL基因相對表達量和單不飽和脂肪酸相對含量呈極顯著負相關（P＜0.01），F(xiàn)ASN相對表達量和單不飽和脂肪酸相對含量呈顯著負相關（P＜0.05）。PGC-1α和UCP-1的相對表達量與飽和脂肪酸相對含量呈正相關，二者都是促進線粒體生物發(fā)生的重要基因，這可能是運動降低脂肪沉積、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的內(nèi)在機制。

表5 脂肪酸相對含量與脂肪代謝相關基因相對表達量的相關性分析Table 5 Correlation analysis between fatty acid contents and relative expression levels of genes associated with lipid metabolism in lamb meat from Sunit sheep

3 結(jié) 論

運動降低了蘇尼特羊的體質(zhì)量，運動組的n-3系列不飽和脂肪酸相對含量顯著降低，運動改變了蘇尼特羊背最長肌中脂肪酸組成，運動后肌內(nèi)脂肪沉積減少，使羊肉嫩度變差。進一步研究發(fā)現(xiàn)，運動后蘇尼特羊脂質(zhì)代謝相關調(diào)控基因的表達升高，肌肉的脂肪代謝增加，可能還促進了部分白色脂肪“棕色化”。綜上所述，運動可以促進蘇尼特羊機體脂肪代謝，但并不能實現(xiàn)改善羊肉品質(zhì)的目的。