段素琴 李琦涵

HSV-2病毒屬于人類(lèi)皰疹病毒家族中α-亞族的成員，有資料顯示，該病毒已造成超過(guò)10億的15～49歲人群感染，每年新發(fā)病例估計(jì)為2300萬(wàn)[1]。生殖器HSV-2感染一般通過(guò)性傳播，感染后終生潛伏于骶背根神經(jīng)節(jié)中，在特定的情況下通過(guò)再激活導(dǎo)致臨床癥狀復(fù)發(fā)或低效價(jià)排毒[2]。生殖器皰疹引起的重要臨床表現(xiàn)還包括復(fù)發(fā)性腦膜炎、新生兒皰疹病毒感染以及自閉癥等。雖然目前抗病毒療法可減短HSV-2臨床癥狀的持續(xù)時(shí)間，但不能完全防止病毒感染或消除潛伏期，顯然其保護(hù)作用是不完全的，因此預(yù)防HSV-2的感染和傳播仍然是疫苗開(kāi)發(fā)的重要目標(biāo)[3～5]。

HSV-2完整病毒顆粒為直徑125nm的球形，其基本結(jié)構(gòu)由內(nèi)向外由核心部分、核衣殼、皮層和包膜組成。HSV-2病毒顆粒感染細(xì)胞的過(guò)程中編碼大約80多種蛋白質(zhì)分子和一些RNA分子，主要包括由病毒包膜糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM等)、病毒核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白(VP4、VP19c、VP21、VP22、VP23、VP24、VP26等)以及約20%病毒蛋白為其復(fù)制增殖相關(guān)的功能蛋白。另外>50%具有編碼功能的蛋白參與了與宿主的相互作用，促使病毒在體內(nèi)得以存活，這也從側(cè)面說(shuō)明了HSV-2病毒結(jié)構(gòu)以及其與宿主細(xì)胞的相互作用具有復(fù)雜性。針對(duì)HSV-2感染后與宿主細(xì)胞的相互作用以及HSV-2編碼蛋白與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的研究，將有助于HSV-2疫苗的研發(fā)以及機(jī)體抗HSV-2病毒免疫應(yīng)答機(jī)制的研究。

一、基因組的基本結(jié)構(gòu)與生物學(xué)意義

HSV-2病毒核心部分約75nm左右，由雙鏈DNA基因組和病毒DNA結(jié)合蛋白構(gòu)成。HSV-2基因組長(zhǎng)約154.7kb，分為獨(dú)特的長(zhǎng)片段(UL)和獨(dú)特的短片段(US)，兩側(cè)是反向重復(fù)序列，如此大的基因組遺傳信息從側(cè)面反映了該病毒的物種進(jìn)化程度及其與宿主細(xì)胞相互作用的復(fù)雜程度[6]。研究表明，HSV-2病毒基因編碼80多種蛋白質(zhì)的基因結(jié)構(gòu)，具有一套相互配合但較為復(fù)雜的激活與抑制、增強(qiáng)與減弱調(diào)控機(jī)制。在HSV-2裂解性增殖的過(guò)程中，編碼80余種的蛋白質(zhì)分子的編碼基因并不是同時(shí)開(kāi)始工作的，在基因的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控機(jī)制下，病毒基因組的立即早期(IE)、早期(E)和晚期(L)基因的有序激活，依次表達(dá)為α、β、γ基因產(chǎn)物，并且這些基因受到轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。

HSV-2病毒基因組DNA的合成是在細(xì)胞核中以滾環(huán)機(jī)制進(jìn)行復(fù)制的，在病毒感染后4h即開(kāi)始復(fù)制，14h后達(dá)到高峰，中間過(guò)程需要多種酶的參與。參與DNA裝配的主要編碼蛋白有UL6、UL12、UL17、UL15、UL25、UL28、UL32、UL33等。UL6基因編碼的12個(gè)蛋白為核衣殼上的DNA入口，存在于核衣殼前體的結(jié)構(gòu)中。UL12間接參與了病毒DNA的包裝過(guò)程。UL25主要將病毒DNA固定于核衣殼內(nèi)，與核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白一起參與DNA的包裝過(guò)程[7]。因此可見(jiàn)HSV-2病毒基因組的增殖性復(fù)制，實(shí)際上是病毒自身調(diào)控蛋白與細(xì)胞內(nèi)特定分子之間相互作用的結(jié)果。

二、HSV-2病毒顆粒三維結(jié)構(gòu)分析

核衣殼包裹在核心部分外面，表現(xiàn)為直徑約為100nm的二十面體的立體對(duì)稱(chēng)性結(jié)構(gòu)。核衣殼不僅為病毒基因組提供了容納空間及保護(hù)性外殼，保護(hù)病毒基因組免受機(jī)械損傷等，并在感染的初期將病毒基因組釋放到宿主細(xì)胞核中，繼而包裝病毒及介導(dǎo)病毒感染宿主細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。

基于物理電子技術(shù)學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)皰疹病毒核衣殼內(nèi)部結(jié)構(gòu)及某些結(jié)構(gòu)蛋白的空間構(gòu)象分析產(chǎn)生了相對(duì)清晰的認(rèn)識(shí)[8,9]。早期通過(guò)密度梯度離心法發(fā)現(xiàn)，在HSV-2感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，?？梢?jiàn)到有3種形式的HSV-2核衣殼出現(xiàn)，亦稱(chēng)A、B、C 型[10]。其中A型核衣殼是空衣殼，是DNA包裝過(guò)程中的流產(chǎn)形式，其中無(wú)DNA和DNA結(jié)合蛋白，始終以空衣殼的形式存在，多見(jiàn)于空衣殼形成的起始階段。B型核衣殼含有DNA結(jié)合蛋白，很少或者不含DNA，為發(fā)育成熟中的衣殼，對(duì)病毒DNA具有親和性，可以引起DNA的進(jìn)入而轉(zhuǎn)化成為C型核衣殼成為有傳染性的病毒顆粒。C型核衣殼位于核周間，由于含有完整的病毒DNA，可以發(fā)展成熟為具有感染力的病毒顆粒。

這3種核衣殼均為二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，主要由955個(gè)150kDa的主要衣殼蛋白VP5排列為150個(gè)六邊形和11個(gè)五邊形，其他關(guān)鍵組件包括：12個(gè)頂點(diǎn)的十二聚體pUL6復(fù)合物；320份“三聯(lián)體”，由VP232和VP19c組成，主要連接相鄰的衣殼；900個(gè)VP26是六邊形外表面的組成部分之一?；谶@樣復(fù)雜的結(jié)構(gòu)背景，HSV-2殼體組裝是一個(gè)復(fù)雜的、嚴(yán)格遵循蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)熱力學(xué)原理的過(guò)程。其中B型核衣殼中特有支架蛋白VP22a，該特有的結(jié)構(gòu)可能在病毒包裝過(guò)程中具有重要的意義，也可能是折疊蛋白VP22a的蛋白水解消化不成功或包裝病毒DNA失敗而產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，但是目前A型和B型核衣殼是流產(chǎn)形式還是裝配中間體仍有爭(zhēng)議[11,12]。

那么這些核衣殼形式在病毒生命周期以及與宿主免疫中是如何發(fā)揮作用的？3種核衣殼結(jié)構(gòu)是否存在來(lái)不及組裝或在包裝的過(guò)程中導(dǎo)致細(xì)胞的裂解后作為病毒抗原與宿主發(fā)生先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)？由于當(dāng)前技術(shù)無(wú)法評(píng)估病毒結(jié)構(gòu)變化的動(dòng)力學(xué)，這些重要問(wèn)題至今仍未得到解答。

三、HSV-2的皮質(zhì)及生物學(xué)意義

在HSV-2的結(jié)構(gòu)成分中，間層蛋白是位于核衣殼與外膜之間的約占30～35nm的蛋白分子，是皰疹病毒所特有的一類(lèi)蛋白，主要參與病毒基因的復(fù)制轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成及阻斷宿主細(xì)胞大分子的合成等作用[13,14]。目前在皰疹病毒成熟顆粒的結(jié)構(gòu)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多種間層蛋白，主要包括VP16(UL36)、VP11/12(UL46)、VP13/14(UL47)、VP16(UL48)、VP22(UL49)、ICP0、ICP4、VHS(UL41)、US2、US3、US10、US11、UL11、UL13、UL14、UL16、UL17、UL21、UL37、UL51、UL56。大多數(shù)間層蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白形式存在，主要通過(guò)之間的相互作用來(lái)錨定在核衣殼或膜上穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu)[15]。又可以作為功能蛋白主要在病毒的復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮特定的生物學(xué)作用(病毒基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能)，例如UL36和UL37。此外也有部分間層蛋白作為特定組分與細(xì)胞因子組分。

一些間層蛋白也參與了病毒的結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，其主要通過(guò)與細(xì)胞分子的相互作用而發(fā)揮重要作用。中間層蛋白VP16和VHS是研究相對(duì)較多的兩種間層蛋白，主要集中在調(diào)節(jié)病毒基因組轉(zhuǎn)錄和干擾宿主RNA合成中的生物學(xué)功能的研究。病毒感染細(xì)胞之后，VP16作為最接近包膜的間質(zhì)蛋白，主要通過(guò)與細(xì)胞表面分子OCT-1、HCF1結(jié)合形成誘導(dǎo)復(fù)合物，識(shí)別α基因上具有調(diào)控功能的TA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而發(fā)揮反式激活作用，誘導(dǎo)5個(gè)立即早期蛋白——感染細(xì)胞多肽ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47的表達(dá)。VP16還能夠與由UL36和UL37基因編碼的兩個(gè)外皮蛋白一起參與支持病毒結(jié)構(gòu)，同時(shí)該蛋白對(duì)包裝后病毒釋放出細(xì)胞也起著重要的作用[16]。VHS作為一種mRNA特異性的RNA酶，能夠引起宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的快速關(guān)閉，在病毒基因從頭合成前就能降解宿主細(xì)胞的mRNA，為病毒增殖期間的轉(zhuǎn)錄提供了空間[17～19]。

研究表明，間層蛋白在細(xì)胞感染的過(guò)程中具有病理學(xué)意義。有研究顯示，間層蛋白在病毒感染的過(guò)程中可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別后下調(diào)病毒的病理學(xué)作用。此外，一些間層蛋白的缺失也會(huì)影響病毒的發(fā)病機(jī)制，例如在病毒感染的細(xì)胞中可見(jiàn)UL7、UL7-UL51復(fù)合體與gE在感染細(xì)胞的核區(qū)域共定位，但是UL7的缺失卻消除了這種共定位[20]。雖然此基因的部分缺失沒(méi)有影響病毒的結(jié)構(gòu)，但是可能會(huì)限制病毒在細(xì)胞或動(dòng)物中的增殖并導(dǎo)致病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)延遲，因?yàn)閁L7調(diào)節(jié)病毒α基因的轉(zhuǎn)錄，可能會(huì)導(dǎo)致病毒的表型減弱[21,22]。由此可見(jiàn)，病毒感染宿主之后大多數(shù)病原性病毒分子都是在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮一定的作用，并且通過(guò)免疫逃逸的方式避免先天性和適應(yīng)性的監(jiān)控。

基于以上的認(rèn)識(shí)，可以認(rèn)為在病毒復(fù)制的過(guò)程中，作為結(jié)構(gòu)蛋白的間層蛋白與作為功能蛋白的α基因具有相似的的生物學(xué)功能。如上所述，HSV-2所具有的復(fù)雜的病毒基因結(jié)構(gòu)和基因調(diào)控系統(tǒng)，均能與宿主細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)相互作用，從而為病毒復(fù)制創(chuàng)造有利的分子生物學(xué)背景，可見(jiàn)病毒在增殖的過(guò)程中發(fā)生了與宿主細(xì)胞多方面、多層次的相互作用。如此結(jié)構(gòu)與功能特性的間層蛋白形成了HSV-2感染細(xì)胞過(guò)程中的特殊背景，為HSV-2感染宿主細(xì)胞構(gòu)建了有利于病毒復(fù)制增殖的微環(huán)境，而該微環(huán)境所表現(xiàn)的抗原特性是否能被感染細(xì)胞所釋放的天然免疫信號(hào)分子激活，以識(shí)別異物分子進(jìn)而被優(yōu)勢(shì)中和抗體反應(yīng)所拮抗或清除尚未有充分的依據(jù)。

四、HSV-2的外膜蛋白及生物學(xué)意義

HSV-2作為一種有包膜的DNA病毒，在最外側(cè)是有多層突起結(jié)構(gòu)的囊膜。外膜蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白可以介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)與宿主細(xì)胞膜上的非特異性的受體結(jié)構(gòu)介導(dǎo)病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合，使病毒進(jìn)入細(xì)胞并完成生物學(xué)功能。此外，外膜蛋白攜帶的抗原表位能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體及CTL應(yīng)答，因此常作為研制HSV疫苗的主要免疫原，在HSV病毒疫苗的研究有重要的作用。

囊膜上有多種病毒編碼產(chǎn)生的糖蛋白(glycoprotein)，到目前為止已發(fā)現(xiàn)有多達(dá)12種，主要與病毒的吸附、入侵和刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)有關(guān)。已經(jīng)證明至少有5種糖蛋白gB、gC、gD、gH和gL能夠與細(xì)胞受體相互作用，從而促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。HSV-2病毒通過(guò)gB或gC與細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素黏蛋白HSPG非特異性的結(jié)合，并與成對(duì)的免疫球蛋白樣2a型受體(PILR)偶聯(lián)后使得病毒與細(xì)胞膜靠近。接著gD與細(xì)胞膜上的特異性的受體結(jié)合(皰疹病毒進(jìn)入介導(dǎo)子HVEM、指蛋白1 nectin1 HveC、指蛋白2 nectin2 HveB、硫酸乙酰肝素黏蛋白 3-OST-3等)后進(jìn)一步啟動(dòng)gH、gL、gK的作用，從而形成包含兩種糖蛋白的復(fù)合物，發(fā)揮gB介導(dǎo)的病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合作用[23～25]。也有數(shù)據(jù)證明gH和gL以細(xì)胞整合素為受體在細(xì)胞膜融合過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，這些從側(cè)面說(shuō)明了HSV-2進(jìn)入細(xì)胞有相對(duì)系統(tǒng)的方式，即在整個(gè)組裝過(guò)程中表現(xiàn)出的特化的、以分子間相互作用方式的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)事件[26]。因此，病毒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程涉及到多種表面糖蛋白與不同的細(xì)胞受體之間的相互作用，這也從側(cè)面支持了完整的中和抗體可能是由多種抗體共同構(gòu)成綜合抗體這一觀點(diǎn)。

近年來(lái)在疫苗研發(fā)方面，gB、gD常被認(rèn)為優(yōu)勢(shì)抗原進(jìn)行抗原肽疫苗的研發(fā)，這些候選疫苗經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在有效性和安全性方面都有較好的結(jié)果[27]。但在臨床試驗(yàn)中，人類(lèi)受試者并未得到相應(yīng)的臨床保護(hù)，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能為糖蛋白是否是人們傳統(tǒng)認(rèn)為的刺激機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)抗原還沒(méi)有得到充分的證實(shí)，可能病毒糖蛋白作為候選疫苗所引起的免疫應(yīng)答，不能刺激病毒感染不同階段瞬時(shí)表達(dá)各種抗原分子，并且病毒表面糖蛋白所產(chǎn)生的特異性抗體和CTL應(yīng)答，無(wú)法真正控制病毒感染宿主細(xì)胞后出現(xiàn)的各種病理性損傷[28，29]。結(jié)合流行病的數(shù)據(jù)表明，人群中血清抗體的存在并不能阻止HSV感染的發(fā)生。

綜上所述，筆者推測(cè)HSV-2病毒感染具有一套完善的免疫逃逸機(jī)制，推測(cè)發(fā)生免疫逃逸的原因可能為病毒進(jìn)化后可以建立潛伏感染功能以及能感染多種細(xì)胞類(lèi)型[30]。主要表現(xiàn)為干擾宿主細(xì)胞PRR對(duì)其PAMP的識(shí)別，抑制干擾素的產(chǎn)生，阻礙補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致多種固有免疫細(xì)胞和特異性免疫細(xì)胞的凋亡降解，從而抑制宿主的抗病毒免疫效應(yīng)及發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象。此外，HSV編碼多種病毒蛋白也是免疫逃逸的原因之一。

五、展 望

目前針對(duì)HSV-2編碼的病毒蛋白分子的抗原特性研究尚未明確，但針對(duì)不同蛋白分子的研究表明，部分蛋白分子存在一定數(shù)量的T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)位點(diǎn)，這決定了機(jī)體針對(duì)這些病毒蛋白出現(xiàn)特異性CTL應(yīng)答及中和抗體。因此，深入認(rèn)識(shí)這些病毒編碼分子的生物學(xué)功能，對(duì)于理解這些蛋白在感染過(guò)程中發(fā)揮的免疫作用具有重要的意義，從而進(jìn)一步認(rèn)識(shí)HSV-2疫苗研究的可行性。