李福興, 張自華, 李雪梅綜述, 趙衛(wèi)東審校

0 引 言

中性粒細胞是機體的免疫防御細胞，作為機體抵御外來病原體侵入的第一道防線，其有一種特殊的細胞死亡形式[1]，在某些細胞因子、病原體或某些化合物的刺激下，活化的中性粒細胞可向細胞外釋放去聚化的染色質，形成網狀結構，該網狀結構被稱為中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)，而產生NETs的過程則被稱為NETosis[2]。NETs不僅可包裹及殺傷外來入侵病原菌起到抗炎作用，還可作為一種自身抗原，發(fā)揮促炎作用，導致多種急慢性炎癥反應的發(fā)生[3]。目前，大量研究表明NETs在腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病及感染性疾病等炎癥性疾病(inflammatory diseases, ID)中發(fā)揮了重要作用[4]。本文就NETs及其在ID發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究進展作一綜述。

1 NETs

早在2004年，Brinkmann等[5]提出了NETs的概念，這是一種新型中性粒細胞死亡形式，其與凋亡和壞死最大的不同是NETs細胞死亡的整個過程染色質是完整連續(xù)的，并不出現染色質固縮等現象[6]?；罨难“?、佛波酯、脂多糖、病原菌等均可促進NETs的形成，這一系列細胞事件精細調控的結果即NETosis。在刺激因素作用下，中性粒細胞細胞質顆粒和核膜發(fā)生溶解，進而失去其本來的分葉狀結構，隨后中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PADI4)等在中性粒細胞核內協調組蛋白高聚亞氨酸化及染色質去皺，促成細胞質與細胞核含量內容物的融合。最終，中性粒細胞細胞膜破裂，核酸和蛋白混合物釋放到胞外形成以核酸為骨架附著大量顆粒蛋白的NETs[7-8]。

2 NETs機制

2.1 經典途徑在脂多糖和腫瘤壞死因子誘導下，中性粒細胞內容物被擠出，中性粒細胞發(fā)生核物質擴散，染色質濃縮，核包膜崩解等過程，隨后細胞質和核組分的混合，質膜破裂，染色質釋放。這一過程依賴Raf-MEK-ERK途徑激活NADPH氧化酶，產生活性氧(ROS)，進而激活受體相互作用蛋白激酶-3—混合譜系激酶樣級聯反應。而這種類型的NETs形成是由補體系統，TLR2和(或)纖維連接蛋白啟動的，染色質以胞內囊泡的方式，以完整的質膜從細胞釋放[9]。

2.2 Gasdermin D途徑最新研究發(fā)現，Gasdermin D蛋白可引發(fā)細胞焦亡和NETs[10]。在正常細胞條件下，Gasdermin D蛋白保持全場的無活性狀態(tài)，當細胞受到脂多糖等刺激后，Gaspermin D則被半胱氨酸蛋白酶或中性粒細胞彈性蛋白酶切，然后，新釋放的Gasdermin D的N端部分發(fā)生寡聚反應，在細胞膜上形成一個裂解孔，靶向和溶解中性粒細胞顆粒膜，釋放出NE和MPO。這些顆粒蛋白的釋放引發(fā)核分離、DNA擴散、組蛋白降解、染色質濃縮和核膜滲透。

3 NETs與炎癥

中性粒細胞可通過吞噬、釋放溶菌酶和形成NETs進而殺滅感染的細菌、真菌，但有研究證實，在機體感染時，NETs也會與細胞毒性、促炎癥、促血栓形成等不良事件密切相關[11]；而在血管炎的患者中存在專門針對NETs的抗體[12]；一項針對SARS-Cov-2的大型研究表明NETs會增加患者的器官損傷，甚至死亡[13-14]；在腫瘤患者中，NETs可促進腫瘤轉移[15]。綜上，NETs在機體內猶如一把雙刃劍，既對病原體起到防御作用，但其也會對宿主造成嚴重損害，其過度浸潤和不受控制的激活可能導致正常組織結構的破壞和不受控制的炎癥，然而，其確切機制目前仍有待深入研究。

4 NETs與炎癥性疾病

4.1 NETs與腫瘤許多實體腫瘤周圍浸潤著中性粒細胞及其他免疫細胞，該過程往往伴隨著炎癥反應，同時在小鼠模型中也發(fā)現，炎癥過程中產生的NETs可喚醒小鼠體內休眠的癌細胞，抑制NETs形成可防止單個播散性癌細胞轉化為不斷增長的轉移性癌細胞[16]。近期NETs在腫瘤中的研究取得重大突破，我國一項研究發(fā)現腫瘤細胞膜上的蛋白CCD25可作為 NET-DNA 受體感知胞外DNA，進而介導腫瘤轉移的發(fā)生，監(jiān)測血液樣本中的 NET-DNA 有望成為評估腫瘤患者預后的一種潛在方法，該研究分析544名乳腺癌患者的原發(fā)性和轉移性腫瘤中的NETs，發(fā)現NET-DNA水平與腫瘤轉移至肝臟之間存在著密切關系，并在小鼠腫瘤模型中得到證實，總的而言，該項研究確定了跨膜蛋白CCD25是DNA的特定感受器，而血液中NETs的水平升高可作為早期預測乳腺癌患者肝轉移的風險標志物，并通過小鼠模型表明CCD25可作為治療腫瘤轉移的潛在靶點，但目前對CCD25蛋白的功能研究尚不完全清晰，其治療的可行性仍有待評估[15]。

國外一項研究發(fā)現，PADI4是NETs形成過程中最關鍵酶，以細胞外DNA水平升高為標志的NETs形成促進了胰腺癌的增殖和轉移。PADI4基因敲除的胰腺癌小鼠存活率明顯提高，該研究表明游離在血液中的中性粒細胞的DNA也與癌癥發(fā)展有著密切關系，通過敲除PADI4基因可有效抑制胰腺癌的生長，這可能是未來胰腺癌治療的新靶點[17]。這些研究均表明，NETs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程密切相關。通過監(jiān)測腫瘤患者血液中的NET-DNA可為腫瘤的轉移提供參考依據，評估患者的預后。同時，參與NETs形成過程以及與NETs相互作用的一些生物分子可能成為腫瘤的治療靶點。

此外，NETs參與腫瘤免疫的機制研究也在進行中。國外團隊首先研究了各種趨化因子、補體C5a、脂多糖等誘導中性粒細胞和GR-MDSC產生NETs的能力，隨后提出CXCR1和CXCR2是誘導NETs產生的最重要受體的假設，并進行了驗證。體外研究發(fā)現激活CXCR1和CXCR2確實可誘導NETs的大量產生，使用CXCR1/R2抑制劑Reparixin后可完全抑制NETs的產生，進一步在小鼠腫瘤模型中，可阻止NETs形成的PADI4抑制劑GSK484，能明顯增強PD-1抗體+CTLA4抗體的療效，且該機制是通過CD8+T細胞實現的。該研究揭示NETs參與腫瘤免疫的機制，為相關趨化因子受體靶點藥物的開發(fā)提供了理論依據[18]。另一項研究發(fā)現彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)患者血漿和腫瘤組織中NETs水平升高與預后不良有關。機制上，DLBCL來源的IL-8與其受體(CXC receptor 2, CXCR2)在中性粒細胞上相互作用，通過Src、p38和ERK信號通路形成NETs。新形成的NETs直接上調DLBCL中的Toll樣受體9(Toll-like receptor 9, TLR9)通路，隨后激活NFκB、STAT3和p38通路以促進腫瘤進展。同時，在小鼠模型中破壞NETs、阻斷IL8-CXCR2軸或抑制TLR9可延緩腫瘤的進展[19]。以上研究均表明NETs參與腫瘤免疫，NETs的產生與CXCR密切相關，進一步揭示了腫瘤與NETs的相互作用，表明NETs是腫瘤潛在的預后生物標志物，并為腫瘤的免疫治療提供了思路。

4.2 NETs與自身免疫性疾病研究表明NETs參與了自身免疫性疾病的發(fā)病進程，國外一項研究在ANCA相關血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)患者的腎組織中檢測到NETs，發(fā)現在髓過氧化物酶誘導下會觸發(fā)NETs進程，并且發(fā)現在ANCA活動期，NETs生成過度，且NETs水平與血清ANCA水平無關，說明NETs水平升高與AAV活動性相關，可更好的指導臨床用藥[20]，此外還有研究發(fā)現AAV患者和系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)患者均具有過量的NETs形成，且這與疾病活動程度相關，但是兩者的機制并不相同，AAV依賴于ANCA的IgG抗體，進而誘導NETs形成，而SLE免疫復合物通過Fcγ受體信號傳導誘導NETs形成，這說明NETs在自身免疫性疾病中機制的多樣性，需要更多的實驗研究來探索[21]。這些研究均表明，在AAV等自身免疫性疾病的發(fā)病進程中會誘導NETs形成，其可能作為一種生物標志物來跟蹤疾病的進展，為臨床用藥提供指導。

在我國一項針對類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的研究中，發(fā)現RA患者的MPO-DNA復合物水平顯著高于健康對照組，其水平與中性粒細胞計數的升高以及類風濕因子和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗體陽性率有關，該研究還發(fā)現RA的活動狀態(tài)與NETosis的增加有關，血清MPO-DNA水平可有效區(qū)分RA患者與健康人[22]。有研究還發(fā)現針對NETs的自身抗體有可能成為類風濕關節(jié)炎的血清生物標志物[23]。最新一項研究則發(fā)現NETs中存在的中性粒細胞彈性蛋白酶既可降解軟骨，又可刺激由成纖維細胞樣滑膜細胞介導的下游炎癥反應，因此，抑制NET形成或阻斷NET中存在的相關分子的作用途徑可能是RA及其相關器官損害的有用治療方法[24]。以上多個研究表明，NETs可能在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生和活動中發(fā)揮作用，相關抗體也為RA的診斷和治療提供參考依據，但需要更多機制性研究提供理論依據。

4.3 NETs與心腦血管疾病NETs與心腦血管疾病的研究也在進行中，研究發(fā)現miR-146a通過調節(jié)NETs的生成，可用來預測心房顫動患者的不良預后[25]。我國一項針對冠狀動脈擴張癥的研究發(fā)現，這些患者的外周血中性粒細胞在IL-1β和可溶性粘附分子的刺激下被激活，從而NETs升高[26]。另外，載脂蛋白E可通過ROS-MAPK-MSK1途徑調節(jié)NETs形成，在載脂蛋白E缺乏的小鼠模型中證實NETs過度生成可加劇小鼠急性心肌梗塞造成的損傷[27]。NETs同樣參與了缺血性腦梗死的進程，當機體發(fā)生缺血性腦梗死時，中性粒細胞浸潤在受損的腦細胞旁，可加劇炎癥，在高遷移率族蛋白B1誘導下，可促進NETosis，在小鼠模型中使用NETosis抑制劑時，不僅延緩了免疫細胞浸潤，而且顯著減輕了血管損傷[28]。以上研究表明NETs可能參與心腦血管疾病的發(fā)病及進展，這為心腦血管疾病的發(fā)病機制提供參考依據和研究方向，NETs抑制劑可能成為治療心腦血管疾病的新藥物。

4.4 NETs與糖尿病近期，NETs在糖尿病中的研究也取得一定突破，高血糖可在中性粒細胞參與下誘發(fā)血管功能障礙，甚至加劇缺血性腦梗死所造成的損傷[29]。我國最新研究發(fā)現MFG-E8通過調節(jié)“NLRP3炎性小體-NETs”軸加速糖尿病的傷口愈合[30]。NETs的形成可導致2型糖尿病小鼠模型的血管損傷[31]。2型糖尿病可能與高凝狀態(tài)和NETs增加有關[32]。此外，1型糖尿病患兒的NETs構成與健康人不同，其外周血單核細胞中的T1D-NET復合物可誘導細胞因子生成，促進T淋巴細胞產生IFN-γ，還發(fā)現NETs誘導的樹突狀細胞活化可導致1型糖尿病的Th1極化，為治療1型糖尿病提供新靶點[33]。增生性糖尿病視網膜病變的患者中的中性粒細胞在無菌炎癥晚期的血管重構中發(fā)揮其非常規(guī)的作用，衰老的脈管系統會分泌吸引中性粒細胞的物質，并誘導其產生NETs，最終清除病變的內皮細胞，重構不健康的血管，此研究亦為治療糖尿病相關視網膜病變開辟新方向[34]。以上研究表明在糖尿病患者中，NETs的形成和增加會對機體血管和免疫系統造成不同的影響，這可能與疾病的發(fā)病機制差異以及NETs產生的數量有關，需要更進一步的疾病機制研究以明確NETs在不同亞型糖尿病中的作用及影響，為疾病的治療提供幫助。

4.5 NETs與感染性疾病NETs最初被認為是一種抗菌機制[5]，近期其在感染性疾病中的研究有了新發(fā)現，國外一項研究證實增強機體NETs的活性，使其更有效捕獲傳染性細菌，從而可最終改善膿毒癥的癥狀以及生存率[35]。而目前在全球大流行的新型冠狀病毒，NETs在其作用機制中發(fā)揮了不可替代的作用，研究發(fā)現中性粒細胞誘導的氧化應激反應，尤其是NETs的產生，會造成機體急性肺損傷、血栓形成等嚴重損害[14]。還有研究發(fā)現破壞性的白細胞與COVID-19患者的病程更嚴重之間存在聯系[36]。最新研究則發(fā)現針對纖溶酶原和NETs相關的中性粒細胞彈性蛋白酶的抗蛋白酶治療可能有利于治療新冠肺炎[37]。這些研究表明NETs可能作為新冠肺炎治療的一個潛在靶點，其在COVID-19中的作用機制仍有待進一步研究。

5 結 語

隨著研究的越來越深入，更多關于NETs的機制在不斷被揭示，其與炎癥反應關系密切，參與了腫瘤、自身免疫性疾病、心腦血管疾病、糖尿病及感染性疾病等ID的疾病進程，但具體機制仍有待探究。現有研究表明，NETs參與了ID的發(fā)生和發(fā)展，其在疾病進展中的產生和增加使其DNA和相關抗體有望成為一種有助于疾病診斷和預后判斷的生物標志物，與NETs產生以及相互作用的相關分子及通路將可能成為ID的治療靶點。綜上所述，NETs在炎癥性疾病中具有重要作用，研究需更加深入，為早日攻克炎癥性疾病提供理論依據和轉化策略。