王孟輝，高 巖，韓建國，張春陽

[1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科疾病研究所(轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué))；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心；4.深圳大學(xué)總醫(yī)院]

脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)被三層膜包裹，而在腦表面包裹的分別是硬腦膜、蛛網(wǎng)膜以及軟腦膜[1]。其中硬腦膜是一種厚而致密的膠原膜，附著在顱骨的內(nèi)表面。它由內(nèi)外兩層組成，外層的硬腦膜緊貼在顱骨下，相當(dāng)于顱骨內(nèi)表面的骨膜，硬腦膜外層又稱骨膜層，含有大量豐富的血管，負(fù)責(zé)顱骨的血供，內(nèi)層又稱腦膜層，相較外層厚而堅(jiān)韌，主要作用是保護(hù)大腦。近些年來，越來越多的證據(jù)表明腦膜積極參與大腦和顱骨的發(fā)育，尤其是硬腦膜對顱骨的形成過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，未成熟的硬腦膜細(xì)胞具有分泌生物因子促使成骨細(xì)胞為分化成為骨細(xì)胞，并且產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白的能力[2]。因此本文僅圍繞硬腦膜與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系展開綜述，通過總結(jié)硬腦膜影響顱骨發(fā)育的機(jī)制以期為今后顱骨發(fā)育的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 硬腦膜與顱骨在胚胎發(fā)育時(shí)期的關(guān)系

許多研究人員已經(jīng)在多種物種中描述了硬腦膜的胚胎發(fā)育，一些工作甚至可以追溯到200多年前，在本文我們將重點(diǎn)描述哺乳動物的過程，其中包括對人類、小鼠和大鼠以及綿羊的研究[3]。硬腦膜起源于發(fā)育中的大腦表面的間充質(zhì)鞘，稱為原發(fā)性腦膜，其具有明顯的組織學(xué)特征。早期胚胎發(fā)育的過程中，間充質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)管關(guān)閉時(shí)開始包圍后腦，并繼續(xù)擴(kuò)散到中腦和前腦水平，這個(gè)鞘是最初期的發(fā)育體，它是腦膜、頭骨和頭皮產(chǎn)生的原基[4]。隨后，在小鼠發(fā)育的E10.5階段，初級原基被劃分為一個(gè)外部致密層和一個(gè)內(nèi)部網(wǎng)狀層，內(nèi)層被認(rèn)為是腦膜間充質(zhì)。 在人類第17卡內(nèi)基階段(懷孕第六周)和小鼠E13階段，大腦周圍的間質(zhì)被組織成多個(gè)不同的層，最外部的層是胚胎真皮層，下一層是所謂的生骨層，因?yàn)樗a(chǎn)生了顱骨[5]。內(nèi)層被認(rèn)為是腦膜間充質(zhì)層,硬腦膜中的淋巴管在出生后早期發(fā)育形成[6]。從細(xì)胞起源上來說，外胚層水平產(chǎn)生的神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞有助于與前腦相關(guān)的腦膜，而中胚層衍生的細(xì)胞產(chǎn)生中腦和后腦的腦膜以及所有腦膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]。 但是值得注意的是，顱骨及骨縫也是來源于中胚層與神經(jīng)嵴細(xì)胞。江曉兵等人通過使用一種轉(zhuǎn)基因小鼠，用一種在神經(jīng)嵴細(xì)胞中表達(dá)的基因Wnt1，其中編碼Cre酶的基因被置于Wnt1啟動子的控制之下， 通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論額骨主要由神經(jīng)嵴衍生細(xì)胞組成，中胚層細(xì)胞的貢獻(xiàn)較小，而頂骨完全由中胚層細(xì)胞組成[8]。 由此可見，在胚胎發(fā)育的過程中，硬腦膜與顱骨發(fā)育的關(guān)系如此緊密。由于顱骨和腦膜形成緊密的結(jié)合，預(yù)計(jì)這兩種結(jié)構(gòu)在發(fā)育過程中會有廣泛的調(diào)節(jié)相互作用，因此，關(guān)于硬腦膜對發(fā)育時(shí)期的顱骨及骨縫的融合過程中的影響顱骨發(fā)育的生物因子開展了廣泛的研究。

2 硬腦膜上影響顱骨發(fā)育的生物因子

眾所周知，各個(gè)顱骨在發(fā)育的早期是不相互連接的，但是各片顱骨之間都有共同的附著點(diǎn)，那就是硬腦膜，各個(gè)顱骨之間的硬腦膜完整是非常重要的，因?yàn)槎喾N分泌分子，包括轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族成員，它們都在硬腦膜中表達(dá)，并被認(rèn)為介導(dǎo)與顱骨的相互作用。在早期研究中的Douglas A. Roth等人通過將額骨骨縫周邊的硬腦膜通過硅膠片隔離開來的方式發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硬腦膜缺損或者有障礙物將硬腦膜骨縫周邊的顱骨隔離開來的時(shí)候，顱骨的發(fā)育就會延遲，骨縫閉合時(shí)間就會變短[9]。這些研究共同表明，硬腦膜對顱骨后期發(fā)育的鈣化模式和形態(tài)形成具有指導(dǎo)作用。關(guān)于硬腦膜分泌分子與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系，主要有以下幾個(gè)方面的研究。

2.1TGFβ信號通路與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)超家族由TGFβs、激活素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)組成。其中 TGFβs和BMPs已被證明可以調(diào)節(jié)膜性成骨再生在骨骼發(fā)育過程中，TGF-β信號促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制成骨分化[10]。其中TGFβs家族成員參與了成骨細(xì)胞活動和代謝方面調(diào)控[11]。在細(xì)胞間信號通路中，有直接證據(jù)表明，轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)信號是硬腦膜正常發(fā)育所必需的，編碼其受體的tgfbr2從早期就在腦膜間充質(zhì)中表達(dá)，而且促進(jìn)了骨生長和成骨細(xì)胞的合成代謝功能[12]。研究發(fā)現(xiàn)了TGF-β1在體外對人成骨細(xì)胞細(xì)胞系(HCEM)增殖和分化的影響，它確實(shí)促進(jìn)了HCEM細(xì)胞的細(xì)胞分化和礦化[13]，而且當(dāng)體內(nèi)局部注射轉(zhuǎn)化生長因子-β同工型(TGF-β1，β2和β3)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在骨骼中含量很高，并刺激顱骨的形成。額后縫融合期間存在強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性成骨細(xì)胞，矢狀縫僅具有輕微的免疫反應(yīng)性。在TGF-β同工型之間觀察到了不同的免疫染色模式，相比而言TGF-β2是最具有免疫反應(yīng)性的同工型，也與硬腦膜和融合骨縫邊緣的成骨細(xì)胞密切相關(guān)[14]。Arun K Gosain等人利用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)作為檢測小鼠顱骨組織中TGF-β1、TGF-β受體1(TGF-βR1)表達(dá)的方法，這些結(jié)果表明，在骨縫間充質(zhì)和硬腦膜之間存在TGF-β1、FGF-2及其受體的組織特異性mRNA表達(dá)[15]。HanJoon M Song等人通過用復(fù)制缺陷型腺病毒去編碼出有缺陷的顯性的負(fù)性II型TGF-β受體(AdDN-TbetaRII)從而阻斷TGF-β信號傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制后額縫合融合[16]。這些研究的觀察結(jié)果表明，硬腦膜-骨縫的相互作用可能通過硬腦膜來源的生長因子以旁分泌的方式發(fā)出信號。這些肽反過來刺激附近的成骨細(xì)胞，從而產(chǎn)生促進(jìn)骨生長的因子，例如骨鈣蛋白，從而影響骨縫的閉合以及后期顱骨的生長與修復(fù)。TGF-β信號在調(diào)節(jié)膜性成骨過程中促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖，抑制成骨分化，并且在顱骨發(fā)育過程中促進(jìn)了成骨細(xì)胞的合成代謝，促進(jìn)了成骨細(xì)胞系的分化與礦化，同時(shí)其對于顱骨發(fā)育后期骨縫閉合具有重要的作用。

2.2骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)超家族中的重要成員之一，是骨骼發(fā)育的重要生長因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP家族在骨縫中的表達(dá)模式以及調(diào)節(jié)其體外表達(dá)的因素有著重要的作用[17]。其中將BMP-2修飾并摻入水凝膠中有增強(qiáng)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的成骨作用[18]，應(yīng)用BMP-2 與功能化巴基管復(fù)合仿生材料修復(fù)兔顱骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，硬腦膜中提取的BMP-2結(jié)合的碳納米材料對于顱骨修復(fù)具有良好的作用，BMP-2多肽通過形成類似與蛋白共價(jià)鍵原理，分別通過羧基和氨基這兩種官能團(tuán)與巴基管結(jié)合，BMP-2 多肽可通過與不同官能團(tuán)形成共價(jià)鍵從而作用更長的時(shí)間[19]。Nacamuli RP對大鼠后額葉和矢狀縫分別在不同的時(shí)間進(jìn)行了基因微陣列分析。應(yīng)用RT-PCR反應(yīng)來分析基因的定量表達(dá)，先是使用由重組人成纖維細(xì)胞生長因子2或重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的原代大鼠的顱骨成骨細(xì)胞，或與原代大鼠非骨縫處的硬腦膜一起培養(yǎng)，確定其對BMP-3表達(dá)的定量調(diào)節(jié)。在所分析時(shí)間的過程中，后額縫中BMP-3的表達(dá)下降，而矢狀縫中BMP3的表達(dá)則增加[20]。BMP-3可增強(qiáng)MSC(人間充質(zhì)干細(xì)胞)增殖和分化，比如增加的細(xì)胞數(shù)量和特定基因表達(dá)，這些作用可能與TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān)[21]。 而核酸酶Cas9(CRISPR-Cas9)技術(shù)對MSC間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)用以表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP-9)，然后對進(jìn)行體外培養(yǎng)大鼠顱骨缺損的成骨細(xì)胞應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的潛能和胞內(nèi)骨形成增強(qiáng)，發(fā)現(xiàn)核酸酶Cas9技術(shù)生成的過表達(dá)的MSC間充質(zhì)干細(xì)胞注射治療的大鼠顱骨缺損顯示出明顯增加的骨形成和骨礦物質(zhì)密度，BMP-9表明可有效增強(qiáng)骨骼形成[22]。而且，在BMP家族中，目前只有BMP-9具有抵抗硬化蛋白Noggin誘導(dǎo)對Smad細(xì)胞信號通路抑制的特性[23]，而且使用BMP-9的體外和體內(nèi)研究已經(jīng)證明了它對成骨的有效性，因此BMP-9被認(rèn)為是BMP家族中最有可能刺激骨祖細(xì)胞分化成為骨細(xì)胞的成員之一[24-26]?？傊?，在BMP家族中，BMP-2具有促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨及礦化的作用，加之其與骨組織仿生材料較易結(jié)合，且不易失活，因此，BMP-2在目前的骨組織工程方面的較為廣泛，BMP-3增強(qiáng)可能與TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的激活有關(guān)的人間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化，而BMP-9具有抵抗Noggin對Smad細(xì)胞信號通路抑制的特性，因此這也是關(guān)于BMP家族研究的熱點(diǎn)之一。

2.3雄激素與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系 長期以來，雄激素在骨顱發(fā)育和骨量維持中起著非常重要作用[27]。相較于血清雄激素水平正常的男性，雄激素缺乏癥的男性骨密度相對較低，并且骨吸收能力也相對有所增加[28]，而且對人和小鼠衍生的成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系的體外研究表明，在培養(yǎng)基中添加睪酮或5-二氫睪酮會刺激顱骨硬腦膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化。分離并培養(yǎng)原代鼠胚胎(E18)硬腦膜細(xì)胞和顱骨成骨細(xì)胞,用雄激素刺激硬腦膜細(xì)胞和顱骨成骨細(xì)胞，通過非放射性增殖測定法去檢查細(xì)胞的增殖。發(fā)現(xiàn)雄激素刺激使胎兒硬腦膜細(xì)胞及顱骨成骨細(xì)胞的增值都有一個(gè)明顯的增加，但硬腦膜細(xì)胞增加更為顯著。雄激素刺激增加了顱骨成骨細(xì)胞堿性磷酸酶和TGF-β1的表達(dá)，所以雄激素刺激胎兒硬腦膜和成骨細(xì)胞從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化，并能誘導(dǎo)骨縫融合[29]。雄激素信號傳導(dǎo)可能通過硬腦膜細(xì)胞分泌及信號通路的促進(jìn)骨分化來刺激骨縫壁成骨，雄激素的增加會刺激顱骨成骨細(xì)胞的增殖，而且運(yùn)用雄激素阻滯劑的情況下會降低成骨細(xì)胞的成骨潛能[30]，這也可能是先天性顱骨畸形不同性別患病率差異的原因。雄激素信號對于不同譜系成骨細(xì)胞分化的影響程度不同，在神經(jīng)嵴起源的細(xì)胞中被增強(qiáng)，而在中胚層起源的細(xì)胞中被抑制。雄激素在體內(nèi)的復(fù)雜作用，這種作用可能細(xì)胞的胚胎譜系和發(fā)育起源有關(guān)[31]。 雄激素在骨顱發(fā)育和骨量維持有著重要作用，通過刺激顱骨成骨細(xì)胞堿性磷酸酶和TGF-β1的表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨細(xì)胞分化，而且對于不同譜系成骨細(xì)胞分化的影響程度不同，這與可能顱骨胚胎的起源有關(guān)。

2.4FGF與顱骨發(fā)育之間的關(guān)系 成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)信號通路已被證實(shí)在調(diào)節(jié)顱面骨的神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)、遷移和分化成骨過程中起著重要的作用[32]。在膜性成骨形成過程中，F(xiàn)GF信號調(diào)節(jié)幾種關(guān)鍵的成骨轉(zhuǎn)錄因子，如Msx1、Msx2和Runx2等等，在顱骨發(fā)育過程中，F(xiàn)GF信號調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨縫閉合，以及FGF信號的突變導(dǎo)致顱縫滑閉，從而導(dǎo)致骨縫的過早融合[33]。但是，也有研究表明，F(xiàn)GF對于顱骨調(diào)節(jié)可能是階段性的，F(xiàn)GF信號突變被證明是促進(jìn)成骨細(xì)胞過早的分化以及功能的增加，但是成纖維細(xì)胞生長因子受體FGfr2的突變，也觀察到成骨細(xì)胞凋亡的增加，導(dǎo)致顱骨滑閉[34]。同時(shí)Kanda等人發(fā)現(xiàn)大鼠骨髓細(xì)胞在FGF培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，細(xì)胞數(shù)量顯著增加，BMP2 和骨橋蛋白等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，推測FGF與BMP2中間可能有著協(xié)同的作用[35]。Gromolak Sandra等人FGF-2和BMP-2處理的綿羊骨髓細(xì)胞(BM-MSC)保持其最初的MSC特性并改善了其成骨分化能力，發(fā)現(xiàn)了骨鈣素和I型膠原的表達(dá)增加以及成骨相關(guān)基因標(biāo)記BMP-2，Runx2，osterix的表達(dá)上調(diào)。此外，綿羊BM-MSCs產(chǎn)生了多種與成骨有關(guān)的生物活性因子，與此同時(shí)補(bǔ)充了FGF-2和BMP-2的培養(yǎng)基會影響細(xì)胞的分泌組特征。所以綿羊成骨誘導(dǎo)的BM-MSCs可以用作細(xì)胞療法[36]。而且最新研究表明，Apert綜合征患者的顱面畸形成因與成纖維細(xì)胞生長因子受體2基因方面的突變具有密切的關(guān)系，使用FGF治療Apert綜合征的基因治療對于骨縫融合和通暢的調(diào)節(jié)與至關(guān)重要，靶向FGF / FGFR信號的生物療法對于治療 Apert綜合征所導(dǎo)致的顱面畸形可能會有一個(gè)更好預(yù)后效果[37]。成纖維細(xì)胞生長因子信號通路在調(diào)節(jié)顱面骨的神經(jīng)嵴細(xì)胞誘導(dǎo)、遷移和分化成骨過程中起著重要的作用，但是這種作用可能是可能是階段性的，促進(jìn)成骨細(xì)過早分化會導(dǎo)致顱縫的早閉，并且其表達(dá)上調(diào)可以引起B(yǎng)MP2 和骨橋蛋白等成骨相關(guān)蛋白表達(dá)明顯增加，這也表明了FGF與BMP2中間可能有著協(xié)同的作用。

3 小結(jié)與展望

硬腦膜與顱骨發(fā)育及其代謝過程有著密切的關(guān)系，無論是在早期胚胎發(fā)育時(shí)期，還是在后來的顱骨發(fā)育形成、骨縫閉合的過程中，甚至是成年之后顱骨的缺損與修復(fù)的過程里，硬腦膜及其上面分泌的生物因子都起著非常重要的作用，這種作用可能與胚胎發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞譜系以及發(fā)育起源有關(guān)，而且在后期的發(fā)育過程中，硬腦膜上的分泌因子可能通過旁分泌的方式誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞對于顱骨形態(tài)以及骨縫的閉合與否產(chǎn)生介導(dǎo)作用，這些生物因子相互作用，相互影響，對于顱骨的礦化以及代謝，維持骨穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用。

此外，盡管目前對與硬腦膜與顱骨發(fā)育相關(guān)生物的研究較多，也取得了一些重要的研究成果，但對于硬腦膜上調(diào)控顱骨發(fā)育的分子機(jī)制仍未十分清晰。隨著未來研究的不斷深入，在不遠(yuǎn)的將來能夠了解硬腦膜上分泌的生物的因子的完整機(jī)制，而且闡明這些生物因子之間的相互作用，才能為未來骨組織工程學(xué)以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)指明研究方向，并且為未來的臨床上顱骨骨縫過早閉合引起的頭顱畸形以及顱骨缺損與修復(fù)奠定理論基礎(chǔ)。