曾令軍，陳 旭，張靈娜，張佳良，宋洪濤，周 欣 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350025）

鹽酸普萘洛爾（propranolol hydrochloride，PPL）是治療嬰幼兒血管瘤的一線和首選藥物[1]?？诜}酸普萘洛爾療效確切，但其存在首過效應(yīng)強(qiáng)、生物利用度低、半衰期短等問題，且不良反應(yīng)發(fā)生率高[2]。普通鹽酸普萘洛爾外用制劑只對淺表型血管瘤有效，對深部型和復(fù)合型血管瘤的治療仍需結(jié)合口服給藥。諸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可顯著提高經(jīng)皮給藥制劑的皮膚滲透性，且能提高其在皮膚尤其是皮膚真皮層的藥物滯留量，有望能提高鹽酸普萘洛爾外用制劑對深部型和復(fù)合型血管瘤的療效[3～5]。因此，課題組擬基于立方液晶載藥技術(shù)將鹽酸普萘洛爾制備成一種納米經(jīng)皮給藥制劑，以期能降低或避免口服給藥帶來的高不良反應(yīng)發(fā)生率，提高鹽酸普萘洛爾的治療效果和患者依從性。前期實驗中，課題組篩選了鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒（PPL-Cubs）的制備方法，并通過單因素考察結(jié)合星點設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化了其最佳處方和制備工藝，結(jié)果制得的PPL-Cubs 包封率低（約50%），遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的80%。立方液晶為多層囊泡結(jié)構(gòu)，類似于多囊脂質(zhì)體，其可能與脂質(zhì)體同樣存在對水溶性化合物包封率較低的問題。鑒于前期研究表明，鹽酸普萘洛爾在不同pH 磷酸鹽緩沖液下的溶解度存在極大差異，因此，本研究擬在立方液晶常規(guī)制備的基礎(chǔ)上，引入“pH 梯度法”的載藥思路，制備PPL-Cubs，以期提高其包封率。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；DV215CD 型分析天平（美國奧豪斯公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；DF-101B 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；高壓均質(zhì)機(jī)（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS 激光粒度測定儀（美國PSS 粒度儀公司）；超濾離心管（100KD，Millipore）。

1.2 試藥

鹽酸普萘洛爾（含量99.9%，常州亞邦制藥有限公司）；單油酸甘油酯（法國GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德國BASF 公司）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 包封率的測定

取PPL-Cubs 適量，裝入超濾離心管中，于4 000 r/min 離心10 min，收集離心液，采用課題組前期建立的鹽酸普萘洛爾含量測定方法測定離心液中游離藥物濃度C游離；取未透析的PPL-Cubs，測定藥物濃度C總；根據(jù)公式EE（%）=[(C總-C游離)/ C總]×100%計算PPL-Cubs 的包封率。

2.2 PPL-Cubs 的制備

2.2.1 注入法

精密稱取單油酸甘油酯9 g 和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml 無水乙醇，20 ℃水浴下攪拌溶解，為A 相；精密稱取鹽酸普萘洛爾3.5 g，加入86 g純化水，20 ℃水浴下攪拌溶解，為B 相。于20 ℃水浴及600 r/min 攪拌速度下，將A 相緩慢地滴加至B 相中，待磁力攪拌1 h 后加入適量純化水使總質(zhì)量為100 g，再在800 bar 壓力下高壓均質(zhì)7 次，得PPL-Cubs。

2.2.2 pH 梯度法

精密稱取單油酸甘油酯適量，40 ℃水浴加熱使融化，為A 相；精密稱取泊洛沙姆407 適量，加入適量純化水，40 ℃水浴加熱使溶解，并用1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至酸性，為B 相；于40 ℃水浴及600 r/min攪拌速度下，將A 相緩慢滴加到B 相中，待磁力攪拌30 min 后，得空白立方液晶納米粒粗品；取空白立方液晶納米粒粗品，高壓均質(zhì)數(shù)次，得空白立方液晶納米粒（B-Cubs）。取鹽酸普萘洛爾溶解于適量純化水中，得鹽酸普萘洛爾水溶液；將鹽酸普萘洛爾水溶液加入一定比例的B-Cubs 中，攪拌均勻，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至一定值，于一定溫度下持續(xù)攪拌一定時間，再放置至室溫，即得PPLCubs。

2.3 B-Cubs 的制備工藝優(yōu)化

前期試驗結(jié)果表明，磁力攪拌速度、時間、溫度、內(nèi)水相pH 值對B-Cubs 的粒徑基本無影響，高壓均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)是影響其粒徑的主要因素，故擬進(jìn)一步優(yōu)化高壓均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)。

2.3.1 高壓均質(zhì)壓力的考察

按照“2.2.2”項下方法，取空白立方液晶納米粒粗品，分別在400、600、800、900、1 000 bar 下高壓均質(zhì)7 次，測定制得B-Cubs 的粒徑及多分散指數(shù)（見表1）。結(jié)果表明，隨高壓均質(zhì)壓力的提高，制得B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)均逐漸減小，當(dāng)均質(zhì)壓力≥900 bar 時，B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)變化較小，故確定高壓均質(zhì)壓力為900 bar。

表1 高壓均質(zhì)壓力的考察（n=3）

2.3.2 高壓均質(zhì)次數(shù)的考察

按照“2.2.2”項下方法，取空白立方液晶納米粒粗品，分別在900 bar 下高壓均質(zhì)3、5、7、9 次，測定制得B-Cubs 的粒徑及多分散指數(shù)（見表2）。結(jié)果表明，隨高壓均質(zhì)次數(shù)的增加，制得B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)均逐漸減小，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)≥7 次時，B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)變化較小，故確定高壓均質(zhì)次數(shù)為7 次。

表2 高壓均質(zhì)次數(shù)的考察（n=3）

2.4 B-Cubs 的處方優(yōu)化

2.4.1 單油酸甘油酯用量的考察

基于優(yōu)化的B-Cubs 最佳制備工藝，按照“2.2.2”項下方法，固定泊洛沙姆407 用量為5%，內(nèi)水相pH 為3.0，考察單油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）對制得B-Cubs 粒徑及多分散指數(shù)的影響（見表3）。結(jié)果表明，隨單油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs 粒徑呈先減小后增大趨勢，多分散指數(shù)則不斷降低，當(dāng)單油酸甘油酯用量為25%時，制得的B-Cubs 具有最小的粒徑和較適宜的多分散指數(shù)，故確定單油酸甘油酯用量為25%。

表3 單油酸甘油酯用量的考察（n=3）

2.4.2 泊洛沙姆407 用量的考察

基于優(yōu)化的B-Cubs 最佳制備工藝，按照“2.2.2”項下方法，固定單油酸甘油酯用量為25%，內(nèi)水相pH 為3.0，考察泊洛沙姆407 用量（3%、4%、5%、6%、7%）對制得B-Cubs 粒徑及多分散指數(shù)的影響（見表4）。結(jié)果表明，制得的B-Cubs 粒徑隨泊洛沙姆407 用量的增加逐漸降低，多分散指數(shù)變化無明顯規(guī)律，但均較?。ǎ?.1）；當(dāng)泊洛沙姆407 用量≥5%時，粒徑變化幅度降低，故確定泊洛沙姆407 用量為5%。

表4 泊洛沙姆407 用量的考察（n=3）

2.5 PPL-Cubs 的包封率影響因素考察

2.5.1 外水相pH 值的考察

根據(jù)前期鹽酸普萘洛爾在不同pH 的PBS 中溶解度測定結(jié)果可知（見表5），鹽酸普萘洛爾在pH≥8.5 時溶解度顯著下降。按照“2.2.2”項下方法，制備內(nèi)水相pH 為3.0 的B-Cubs，并按載體/藥物比（以單油酸甘油酯/鹽酸普萘洛爾計）為6∶1的比例與B-Cubs 和鹽酸普萘洛爾水溶液進(jìn)行混合，以10%氫氧化鈉溶液分別調(diào)節(jié)外水相pH 至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水?。ㄝd藥溫度）下600 r/min磁力攪拌15 min（載藥時間），制得PPL-Cubs 中藥物濃度為1%，測定對包封率等參數(shù)影響（見表6）。結(jié)果表明，PPL-Cubs 的包封率隨外水相pH 值的提高逐漸增加，當(dāng)外水相pH 值≥8.5 時，包封率增加趨勢漸?。煌馑鄍H 值對PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無明顯影響。

表5 鹽酸普萘洛爾在不同pH PBS 中的溶解度（n=3）

表6 外水相pH 值的考察（n=3）

2.5.2 內(nèi)水相pH 值的考察

按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5 時，分別考察內(nèi)水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）對制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見表7）。結(jié)果表明，不同內(nèi)水相pH 的B-Cubs 對制得的PPL-Cubs包封率無明顯差異，對PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)亦無明顯影響。

表7 內(nèi)水相pH 值的考察（n=3）

2.5.3 載體/藥物的考察

按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5 時，分別考察載體/藥物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）對制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見表8）。結(jié)果表明，當(dāng)載體/藥物≥6 時，PPL-Cubs 的包封率不再增加；載體/藥物比值對PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無明顯影響。

表8 載體/藥物的考察（n=3）

2.5.4 載藥溫度的考察

按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5 時，分別考察載藥溫度（20、30、40、50 ℃）對制得PPLCubs 包封率等參數(shù)的影響（見表9）。結(jié)果表明，載藥溫度對PPL-Cubs 的包封率、粒徑和多分散指數(shù)無明顯影響。

表9 載藥溫度的考察（n=3）

2.5.5 載藥時間的考察

按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5 時，分別考察載藥時間（15、30、45、60 min）對制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見表10）。結(jié)果表明，載藥時間對PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)無明顯影響。

表10 載藥時間的考察（n=3）

2.5.6 B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)的考察

通過調(diào)整高壓均質(zhì)壓力，制備不同粒徑B-Cubs。按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5，分別考察B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)對制得PPL-Cubs包封率等參數(shù)的影響（見表11）。結(jié)果表明，BCubs 的粒徑和多分散指數(shù)不影響所制得PPLCubs 的包封率，但B-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)基本決定了制得PPL-Cubs 的粒徑和多分散指數(shù)。

表11 B-Cubs 粒徑和多分散指數(shù)的考察（n=3）

2.5.7 PPL-Cubs 藥物濃度的考察

按照“2.5.1”項下方法，固定外水相pH 為8.5，分別考察藥物濃度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）對制得PPL-Cubs 包封率等參數(shù)的影響（見表12）。結(jié)果表明，隨著PPL-Cubs 中藥物濃度的提高，包封率呈逐漸增加趨勢，當(dāng)藥物濃度≥1%時，包封率增加趨勢變慢。

表12 PPL-Cubs 中藥物濃度的考察（n=3）

2.6 pH 梯度法制備PPL-Cubs 的最優(yōu)處方及制備工藝

精密稱取單油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加熱使融化，為A 相；精密稱取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g 純化水，40 ℃水浴加熱使溶解，并用1%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.0，為B 相；于40 ℃水浴及600 r/min 攪拌速度下，將A 相緩慢滴加到B 相中，待磁力攪拌30 min 后，再在900 bar 下高壓均質(zhì)7 次，得B-Cubs。取鹽酸普萘洛爾1 g，溶解于適量純化水中，得鹽酸普萘洛爾水溶液；將鹽酸普萘洛爾水溶液加入24 g B-Cubs 中，攪拌均勻，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至8.5，于20 ℃水浴持續(xù)攪拌15 min，再放置至室溫，即得PPL-Cubs

3 討論

立方液晶納米粒常用的制備方法包括注入法、熔融-分散法、熱處理法、噴霧干燥法等[6]。試驗前期以粒徑、包封率等為評價指標(biāo)篩選了最佳制備方法為注入法，并優(yōu)化了其最佳處方制備工藝，結(jié)果制得的載藥立方液晶納米粒包封率較低（約50%）[7]。立方液晶是兩親性脂質(zhì)分子分散在過量水中形成的含雙連續(xù)水區(qū)和閉合脂質(zhì)雙分子層的蜂窩狀液晶結(jié)構(gòu)；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂質(zhì)雙層膜中，兩親性分子則貫穿其中。鹽酸普萘洛爾在酸性環(huán)境下具有較高的溶解性，常規(guī)方法制得的鹽酸普萘洛爾立方液晶納米粒pH 約為3.5，如何讓其具有進(jìn)入立方液晶載體內(nèi)相的“動力”是提高載藥立方液晶納米粒包封率的關(guān)鍵。因此，本研究引入“pH 梯度法”，通過創(chuàng)造高溶解度內(nèi)環(huán)境（低pH 值內(nèi)水相）和低溶解度外環(huán)境（高pH 值外水相），給鹽酸普萘洛爾提供進(jìn)入立方液晶載體內(nèi)相的“動力”。離子化的鹽酸普萘洛爾在調(diào)節(jié)pH 的過程中逐漸變?yōu)榉肿有螒B(tài)的普萘洛爾而進(jìn)入脂質(zhì)區(qū)，脂質(zhì)區(qū)的普萘洛爾分子接觸內(nèi)水相酸性環(huán)境而被離子化，內(nèi)水相中離子化的鹽酸普萘洛爾無法再通過脂質(zhì)區(qū)而被捕獲于內(nèi)水相。結(jié)果表明，pH 梯度法顯著提高了PPL-Cubs 的包封率，包封率達(dá)到90%。