袁媛 馬嘉燁 劉旭暉 夏露 劉萍 賈曉龍 盧水華

由于結(jié)核病普遍存在的診斷延遲，發(fā)病后進行藥物治療不能充分杜絕結(jié)核病的傳播。為了實現(xiàn)消滅結(jié)核病的目標(biāo)，在結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection, LTBI)階段實施藥物預(yù)防可以大幅度降低結(jié)核病的發(fā)病和傳播。2011年美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)建議每周1次的異煙肼和利福噴丁的短期療程聯(lián)合治療12周(3HP)以治療LTBI[1]；2020年發(fā)布的LTBI治療指南中也推薦使用高劑量短療程的預(yù)防性治療方案(3HP)[2]。多數(shù)已發(fā)表的文獻表明，在成人及兒童中聯(lián)用異煙肼與利福噴丁比單獨使用異煙肼可縮短治療時間，同時有較高的治療完成率[3-4]。目前，我國還沒有廣泛開展結(jié)核病預(yù)防性治療，原因之一是缺少國內(nèi)臨床證據(jù)，對藥物的有效性和安全性評估不充分；截至2021年初，公開發(fā)表的數(shù)據(jù)依然極為有限。本研究以臨床試驗的方式評估了異煙肼、利福噴丁預(yù)防劑量在漢族人群中的藥代動力學(xué)表現(xiàn)以及安全性，為國家制定實施政策提供基礎(chǔ)依據(jù)。

資料和方法

一、研究設(shè)計和對象

本研究采用平行組設(shè)計，于2019年10—12月在上海市公共衛(wèi)生臨床中心開展生物等效性(bioequivalence, BE)研究。通過公開招募的方式入組健康受試者，經(jīng)過書面知情同意，服用研究藥物后留取血液標(biāo)本進行藥代動力學(xué)檢測并記錄服藥后72 h內(nèi)的不良事件。研究流程及知情同意書均經(jīng)過上海市公共衛(wèi)生臨床中心倫理委員會審閱批準(zhǔn)(2019-S028-03)。

2019年10—12月上海市公共衛(wèi)生臨床中心招募36名健康受試者按1∶1隨機區(qū)組分為國產(chǎn)制劑組(T組)18名和參比制劑組(R組)18名, T組單次口服國產(chǎn)異煙肼、利福噴丁各900 mg，R組口服異煙肼、利福噴丁參比制劑各900 mg，每組隨機一半受試者空腹服藥(T1組9名，R1組9名)，另一半受試者餐后服藥(T2組9名，R2組9名)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)活動性結(jié)核病患者；(2)罹患嚴(yán)重的心肺疾病、嚴(yán)重營養(yǎng)不良、中度以上腎功能異常，長期服用免疫抑制劑等可能對藥代動力學(xué)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響者；(3)血常規(guī)、肝腎功能、電解質(zhì)、心肌酶譜、胸部X線攝片、凝血功能篩查等存在研究者認為有意義的異常結(jié)果；(4)嚴(yán)重過敏性疾病和(或)過敏體質(zhì)(對2種或2種以上食物過敏者)；(5)妊娠期或哺乳期婦女；(6)2周內(nèi)用藥史、吸毒史和飲酒史；(7)半年內(nèi)重大臟器手術(shù)史；(8)3個月內(nèi)獻血史；(9)研究者認為可能存在依從性不良或研究藥物可能危及受試者健康的情況。

活動性結(jié)核病定義與《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[5]一致；實驗室檢測結(jié)果超過20%正常參考范圍，經(jīng)研究者鑒定后視為有意義的異常結(jié)果；影像學(xué)異常經(jīng)放射科醫(yī)師判斷證實后視為有意義的異常結(jié)果。

二、研究方法

(一)受試者分組方法

篩選期共75名受試者簽署知情同意書，最終38名符合入組標(biāo)準(zhǔn)，但有2名沒有合適的匹配，僅作為候補人員入選，最終只有36名受試者參加了研究。共匹配男性12對，女性6對，最終T1、R1、T2、R2組各有6男3女。排除的37名受試者原因包括28名體檢或?qū)嶒炇覚z查異常，2名未按照流程完成檢查，4名肺部影像異常，3名因個人原因未參加本研究。

1.通過性別、體質(zhì)量、年齡進行匹配，每對為一區(qū)組，通過隨機區(qū)組的方法，分為2組，隨機產(chǎn)生數(shù)字，使得每一對中兩人隨機服用國產(chǎn)制劑(T組)和參比制劑(R組)。

2.按照上述配對分組序號，前6對男性和前3對女性為一組，后6對男性和后3對女性為一組，1∶1簡單隨機分為空腹組(標(biāo)記為1)和餐后組(標(biāo)記為2)。

(二)研究藥物及給藥方法

研究藥物選用中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的商業(yè)流通用于治療結(jié)核病的異煙肼和利福噴丁口服制劑(詳見利益沖突聲明)，參比制劑包括利福噴丁片(PRIFTIN?, SANOFI, USA)和異煙肼片(ISONIAZID, Teva, USA)。 藥物按照直接面視下督導(dǎo)服藥的規(guī)則在規(guī)定時間集中口服異煙肼和利福噴丁各900 mg，200 ml溫水送服，每次服藥間隔1 min，服藥后檢查口腔并要求端坐觀察2 h。

(三)不良事件的觀察記錄

不良事件嚴(yán)重程度分級參照“常見不良反應(yīng)事件評價標(biāo)準(zhǔn)(CTCAE)4.0.3版”[6]。主要的觀察內(nèi)容包括服藥后72 h內(nèi)發(fā)生的局部或全身不良反應(yīng)，以及其他任何相關(guān)或不相關(guān)的不良事件。服藥后24 h內(nèi)受試者集中觀察記錄，同時在0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 12.0, 16.0, 24.0 h詢問受試者的主觀感受，24～72 h受試者可自行選擇離院或留院觀察，72 h回訪記錄期間發(fā)生的不良事件并進行血液測試。

(四)藥代動力學(xué)樣本采集

給藥前(0 h)和給藥后0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 12.0、 16.0、 24.0、 36.0、 72.0 h(共20個采血時間點)，分別采集靜脈血約3 ml至含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，室溫輕柔顛倒混勻，2～10 ℃，轉(zhuǎn)速1700 r/min，離心10 min(離心半徑15 cm)分離血漿，離心后的血漿樣品室溫條件將分成兩份，約(0.7±0.1) ml血漿加入測試管，剩余血漿加入備份管，分裝完成后及時轉(zhuǎn)移至-20 ℃及以下的冰箱暫時凍存，后續(xù)需及時集中轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱繼續(xù)保存直至轉(zhuǎn)運。給藥前受試者上肢安放一留置針，每次采集血液樣本前抽約1.0 ml血(含封管液及靜脈血)棄去。測試樣本將運送至樣本檢測實驗室(經(jīng)資質(zhì)認定)進行血藥濃度的分析。凍存管標(biāo)簽記錄以下信息：方案編號、受試者編號、采集時間點、樣品種類(測試樣及備份樣標(biāo)示)等。

(五)血漿樣本分析方法

1. 樣品處理：(1)預(yù)制備樣品(于2.2 ml 96孔聚丙烯板中，冰浴，黃光)：①對于混合標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控樣品、系統(tǒng)適用性樣品、平衡樣品(除平衡空白樣品)和測試樣品等，混合樣品(50.0 μl)+內(nèi)標(biāo)工作溶液[50.0 μl，5.00 μg/ml (利福平-d4)/5.00 μg/ml (異煙肼-d4)]。②對空白樣品(Double Blank)、平衡空白樣品，混合空白基質(zhì)(50.0 μl)+ 75%甲醇含1 mg/ml L-抗壞血酸(50.0 μl)。③對空白質(zhì)控樣品(QC0)，混合空白基質(zhì)(50.0 μl)+內(nèi)標(biāo)工作溶液[50.0 μl，5.00 μg/ml (利福平-d4)/5.00 μg/ml (異煙肼-d4)]。④對定量上限不添加內(nèi)標(biāo)樣品(ULOQ without IS)，混合ULOQ樣品(50.0 μl)+75%甲醇含1 mg/ml L-抗壞血酸(50.0 μl)。(2)以上樣品板振搖混勻1 min 后，向所有樣品中加入400 μl的乙腈，振搖混勻約5 min。(3)分別轉(zhuǎn)移50.0 μl上清液至另外兩塊干凈的96孔聚丙烯板中。(4)對于其中一塊96孔聚丙烯板，向所有樣品中添加450 μl 100%純水含10 μg/ml 的L-抗壞血酸，渦旋混勻，用于檢測待測物異煙肼的濃度。對于另一塊96孔聚丙烯板，向所有樣品中添加450 μl 75%甲醇含10 μg/ml的L-抗壞血酸，渦旋混勻后轉(zhuǎn)移100 μl至另一干凈的96孔聚丙烯板中，向所有樣品中加入200 μl 100%純水含10 μg/ml 的L-抗壞血酸，渦旋混勻，用于檢測待測物利福噴丁和25-脫乙酰利福噴丁的濃度。

2.儀器及條件：(1)液相及進樣系統(tǒng)：利福噴丁及25-去乙酰利福噴丁采用的是Waters Acquity UPLC?，異煙肼采用的是島津 LC-30AD；質(zhì)譜：利福噴丁及25-去乙酰利福噴丁采用的是API5000, Applied Biosystems/AB Sciex，異煙肼采用的是API4000，Applied Biosystems/AB Sciex。(2)液相色譜條件：利福噴丁及25-去乙酰利福噴丁的液相色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm×50 mm, 1.7 μm, Waters，柱溫為40 ℃，自動進樣器溫度為4 ℃，流動相A為純水含0.1%甲酸，流動相B為乙腈，利福噴丁保留時間約為1.22 min、25-脫乙酰利福噴丁保留時間約為0.943 min；異煙肼的液相色譜柱為AQ-C18 HP 3 μm, 2.1 mm×100 mm, GL Sciences，柱溫為40 ℃，自動進樣器溫度為8 ℃，流動相A為100%純水含10 mmol/L醋酸銨，流動相B為100%乙腈，異煙肼保留時間為2.15 min、異煙肼-d4為2.12 min。(3)質(zhì)譜條件：利福噴丁及25-去乙酰利福噴丁的質(zhì)譜模式為電噴霧離子源(ESI)，正離子模式(Positive)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，質(zhì)譜采集時間為3.2 min；異煙肼的質(zhì)譜模式為電噴霧離子源(ESI)，正離子模式(Positive)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，質(zhì)譜采集時間為4.2 min。

三、藥代動力學(xué)參數(shù)計算和統(tǒng)計學(xué)處理

采用Phoenix WinNonlin 8.1軟件，基于血藥濃度數(shù)據(jù)，按實際采樣時間點以非房室模型(NCA)進行藥代動力學(xué)參數(shù)計算。

結(jié) 果

一、受試者基本信息以及服藥后實驗室指標(biāo)的變化

受試者一般資料及實驗室檢測結(jié)果見表1。

二、藥代動力學(xué)參數(shù)

分別對健康受試者空腹和餐后服用國產(chǎn)制劑(T)和參比制劑(R)后進行利福噴丁、25-去乙酰利福噴丁和異煙肼的藥代動力學(xué)參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)制劑和參比制劑的藥代動力學(xué)相似。其中，健康受試者服用國產(chǎn)和參比制劑，餐后比空腹，利福噴丁的體內(nèi)暴露量更高。服用含高熱量和高脂肪餐食后，服用國產(chǎn)制劑與服用參比制劑的受試者相比，體內(nèi)利福噴丁和25-去乙酰利福噴丁的暴露量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而健康受試者空腹或餐后服用參比和國產(chǎn)制劑后，異煙肼的體內(nèi)暴露量均相似。見圖1～6、表2。

圖1～6 健康受試者空腹和餐后服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后的平均血藥濃度-時間曲線。圖1為健康受試者空腹服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后利福噴丁的平均血藥濃度-時間曲線；圖2為健康受試者餐后服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后利福噴丁的平均血藥濃度-時間曲線；圖3 為健康受試者空腹服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后25-去乙酰利福噴丁的平均血藥濃度-時間曲線；圖4為健康受試者餐后服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后25-去乙酰利福噴丁的平均血藥濃度-時間曲線；圖5為健康受試者空腹服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后異煙肼的平均血藥濃度-時間曲線；圖6為健康受試者餐后服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后異煙肼的平均血藥濃度-時間曲線

表2 健康受試者空腹和餐后服用國產(chǎn)(T)和參比制劑(R)后藥代動力學(xué)參數(shù)

三、生物等效性評價

通過單雙側(cè)t檢驗及(1-2α%)置信區(qū)間法，得到兩種制劑Cmax或AUC0～t幾何均值比值的90%CI，對于非窄治療窗的藥物，此90%CI必須落在80.0%～125.0%范圍內(nèi)，則判斷為等效性制劑。本研究中口服國產(chǎn)制劑和參比制劑后，Cmax幾何均值比的90%CI以及AUC0～t的幾何均值比的90%CI均不完全處于在等效區(qū)間范圍內(nèi)。按照預(yù)設(shè)的等效性標(biāo)準(zhǔn)，國產(chǎn)制劑和參比制劑不是生物等效性制劑。詳見表3。

表3 健康受試者空腹服用國產(chǎn)制劑(T)和參比制劑(R)后的藥代動力學(xué)參數(shù)點估計值和90%CI

續(xù)表3

四、安全性評價

未發(fā)現(xiàn)3～4級不良反應(yīng)，發(fā)生1～2級不良反應(yīng)的受試者共4名，第1名空腹服用國產(chǎn)制劑后2 h內(nèi)出現(xiàn)輕度惡心，次日晚間出現(xiàn)低熱乏力，持續(xù)數(shù)小時后消失；第2名和第3名空腹服用參比制劑后2 h內(nèi)出現(xiàn)輕度惡心、輕度眩暈不適，分別于2.5 h和0.5 h后緩解；第4名空腹服藥后第48～72 h出現(xiàn)輕度胃部不適，后自行消退，于回訪時上報。相應(yīng)的實驗室指標(biāo)未見有臨床意義的異常變化。

討 論

盡管國內(nèi)商品化流通的異煙肼、利福噴丁制劑都通過了安全性和有效性認證，然而沒有證據(jù)表明這些藥物在高劑量條件下依然能與參比制劑達到生物等效性。本研究以臨床試驗的形式評估了高劑量異煙肼、利福噴丁在漢族人群中的藥代動力學(xué)表現(xiàn)和短期安全性，并與參比制劑進行了生物等效性評價。結(jié)果證實,在健康受試者中，高劑量異煙肼、利福噴丁的短期安全性良好，但研究所用國產(chǎn)異煙肼、利福噴丁制劑與參比制劑之間沒有達到生物等效性。雖然這種藥代動力學(xué)差異對實際預(yù)防效果帶來的影響還不明確，但值得持續(xù)研究和關(guān)注。

Sterling等[3]在3HP方案中也是予以900 mg異煙肼/利福噴丁的劑量，但是對于體質(zhì)量<50 kg的受試者予以增量調(diào)整，而本試驗入組的受試者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在17～27之間，并沒有女性受試者存在體質(zhì)量低于50 kg的情況，故研究的給藥劑量均為900 mg，由于男女性BMI標(biāo)準(zhǔn)不一，對結(jié)果可能有一定的影響，但本研究對于后期研究仍有參考價值。服用參比制劑的受試者，餐后組比空腹組體內(nèi)利福噴丁和25-去乙酰利福噴丁的暴露量增加了約50%，該結(jié)果與參比制劑在歐美、亞非等受試者中的結(jié)果較一致[2,7]； Langdon等[8]在健康人和HIV感染患者中均測定了利福噴丁及25-去乙酰利福噴丁，其中健康人餐后服用利福噴丁、25-去乙酰利福噴丁Cmax分別為23.24和13.81 μg/ml，與本研究結(jié)果的26.5和12.4 μg/ml相近；以上結(jié)果提示種族差異對利福噴丁藥代動力學(xué)的影響較小，或者可能是不同企業(yè)生產(chǎn)的利福噴丁的崩解力是有輕微差距的，未來可以做膠囊和片劑崩解力的相關(guān)試驗。服用國產(chǎn)制劑的受試者中，餐后組比空腹組體內(nèi)利福噴丁和25-去乙酰利福噴丁的暴露量分別增加21%和40%，推測可能由于利福噴丁國產(chǎn)制劑為膠囊劑，與參比利福噴丁片劑相比，兩者受食物影響的程度不一致。

楊清鑾等[9]在矽肺患者中使用了3HP方案預(yù)防肺結(jié)核，空腹服藥后利福噴丁和25-去乙酰利福噴丁的Cmax分別為32.2和15.1 μg/ml，AUC0～t分別為919.6和660.1 μg·h/ml，異煙肼的Cmax為3.7 μg/ml，AUC0～t為14.1 μg·h/ml。這個研究中無論異煙肼還是利福噴丁的藥代動力學(xué)都與本研究有一定的差距，部分原因可能是由于本研究是單次服藥后的結(jié)果，而矽肺患者是連續(xù)服藥第8周后采血測定的結(jié)果，但同時也提示異煙肼和利福噴丁的藥代動力學(xué)表現(xiàn)在不同人群中的異質(zhì)性可能比較大，因此，在未來實施大范圍預(yù)防性治療時，需要考慮人群異質(zhì)性對安全性和有效性帶來的挑戰(zhàn)。

Savic等[10]預(yù)測多種劑量利福噴丁AUC0～24，其每天1次20 mg/kg劑量下，空腹與餐后AUC0～24分別為496和645 μg·h/ml，本研究中空腹及餐后AUC0～t分別為479.3和779.7 μg·h/ml。兩組數(shù)據(jù)存在差異的原因可能是源于兩個研究中選用的時間截點不同(前者是24 h，后者是72 h)。有研究在肺結(jié)核患者中測定不同劑量的利福噴丁的藥代動力學(xué)參數(shù)，其中900 mg利福噴丁的AUC0～t為410 μg·h/ml，25-去乙酰利福噴丁AUC0～t為349 μg·h/ml[11-12]。與本研究數(shù)據(jù)479.3和283.0 μg·h/ml有差異，這個差異可能是源于肺結(jié)核患者和健康人的體內(nèi)藥物代謝情況差異及聯(lián)合用藥的影響。Dooley等[13]研究了不同劑量利福噴丁的藥代動力學(xué)，服用高脂餐后的10 mg/kg利福噴丁Cmax為17.1 μg/ml，AUC0～inf為428 μg·h/ml。本研究中等劑量利福噴丁的Cmax為15.2 μg/ml，AUC0～t為479.27 μg·h/ml，產(chǎn)生差異的原因可能是給藥方式的不同，他們的研究中連續(xù)給藥14 d，而本研究是單次給藥。 盡管Tam等[14]在1997年發(fā)表的研究中認為國產(chǎn)利福噴丁的生物利用度僅為參比制劑的74%，但這一結(jié)果未能在本研究中證實。究其原因，兩個研究所用藥物來源不同，聯(lián)合用藥情況不同，人群不同，藥代動力學(xué)檢測方法也不相同，因此可比性有限。

本研究中受試者服用國產(chǎn)制劑和參比制劑前和72 h后的實驗室指標(biāo)無顯著差異，變異的極值也沒有臨床意義，考慮到兩種藥物在72 h后都基本完成代謝過程，利福噴丁在肝臟、膽道中藥物累積弱于利福平，其他組織無明顯藥物累積情況，且未有研究表明該藥抗生素后效應(yīng)對安全性的影響，因此推測健康成年人單次服用異煙肼900 mg/利福噴丁900 mg短期是基本安全的。但這個結(jié)果不能完全推廣到所有人群，如上文所述，不同人群的藥代動力學(xué)差異可能比較大，不同飲食習(xí)慣、聯(lián)合用藥等也可能造成較大的異質(zhì)性。本研究提供了高劑量異煙肼、利福噴丁的初步藥代動力學(xué)證據(jù)，未來還需要大樣本人群的研究以評估其用于中國人群中的安全性和有效性。

本研究是一個初步研究，有一定的局限性。首先，由于缺少既往研究做參考，樣本量的計算不充分，因此結(jié)果中顯示的非等效性可能與樣本量有關(guān)，本研究結(jié)果還需要進一步驗證。其次，空腹組受試者服藥后，異煙肼吸收較迅速，如圖5所示，大部分受試者在第一個采血點(0.5 h)即達峰濃度，因此由于吸收和分布相采血點數(shù)量不足，可能導(dǎo)致相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)計算存在一定誤差。再次，本研究僅評估了兩種藥品的藥代動力學(xué)情況，不代表國內(nèi)流通的所有藥品，由于缺少公開資料，目前很難推測其他同類藥品的藥代動力學(xué)表現(xiàn)。最后，本研究只是初步研究，由于研究局限性，做不到長期隨訪，因此本文的數(shù)據(jù)僅為藥物吸收方面的比較，難以得出藥物長期分布和消除的差異。

綜上所述，高劑量異煙肼、利福噴丁國產(chǎn)制劑和參比制劑在體內(nèi)的吸收、分布與消除過程有一定的差異，因此市面上流通的異煙肼、利福噴丁制劑是否適用于結(jié)核病預(yù)防性治療尚未可知。在國內(nèi)大規(guī)模開展結(jié)核病藥物預(yù)防之前有必要進一步評估預(yù)防制劑的有效性和安全性，制定適合中國國情的預(yù)防性治療實施策略。

利益沖突聲明本研究的實施受到江蘇南京先聲藥業(yè)有限公司的技術(shù)支持和部分經(jīng)費資助；本研究中未使用任何由江蘇南京先聲藥業(yè)有限公司或其關(guān)聯(lián)企業(yè)生產(chǎn)的藥品；由于潛在的利益沖突，本研究中不公開披露所用國產(chǎn)制劑的來源，但如有研究需要，可以聯(lián)系通信作者獲取藥品信息。這項研究得到上海市臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(shslczdzk03002)的資助，對此研究者無利益沖突。

志謝感謝束盼博士和宋忠金博士在本研究中的悉心幫助，兩位在藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析和臨床試驗設(shè)計上提供了大量技術(shù)支持。