王壘壘，吉蘇珍，劉志峰

1滄州市中心醫(yī)院腦科院區(qū)神經(jīng)外科，河北滄州061000；2滄州市中心醫(yī)院西院區(qū)急診ICU

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。由于多數(shù)病例確診較晚、治療抵抗等原因，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率較高，患者中位生存期僅為14個(gè)月[1-4]。因此，進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)新的治療靶點(diǎn)的開發(fā)有重要意義。CRMP2是一種微管相關(guān)蛋白，在神經(jīng)組織中表達(dá)豐富，除了崁合于微管側(cè)壁穩(wěn)定微管促進(jìn)微管組裝之外，還作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子參與細(xì)胞遷移、分化、突起生長(zhǎng)、可塑和再生等病理生理過程。研究顯示，CRMP2翻譯后修飾在其功能調(diào)節(jié)中起到了至關(guān)重要的作用[5-10]。SUMO蛋白質(zhì)修飾化是存在于各種細(xì)胞生物學(xué)過程中的翻譯后調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞周期等。Ucb9是一種綴合酶，近期研究人員發(fā)現(xiàn)，感覺神經(jīng)元中存在CRMP2的蛋白修飾化位點(diǎn)，這一位點(diǎn)可被Ubc9修飾[11-13]。2020年6月—2021年8月，觀察了SUMO蛋白質(zhì)修飾化CRMP2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)變化及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 A172、U87、GL15購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。CRMP2、SUMO1、UBE2I/UBC9、Human IgG一抗及β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。人CRMP2的全長(zhǎng)編碼區(qū)基因購(gòu)自美國(guó)OriGene公司。Q5?定點(diǎn)誘變?cè)噭┖匈?gòu)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室。Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)標(biāo)記購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司。紅色熒光疊氮化物AlexaFluor?594購(gòu)自美國(guó)賽默飛科技公司。

1.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ucb9、CRMP2、SUMO蛋白質(zhì)修飾化CRMP2檢測(cè) 采用Western blotting法。提取3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞總蛋白。取150 μg蛋白，100 g/LSDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。0.05 g/mL脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性兔抗人CRMP2(1∶1 000)、SUMO1(1∶1 500)、UBE2I/UBC9(1∶500)、IgG(1∶2 000)一抗，以β-actin作為內(nèi)參，4 ℃過夜。加入小鼠抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育1 h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描．以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。選取能穩(wěn)定表達(dá)膠質(zhì)瘤所特有的細(xì)胞標(biāo)志物，并已用于多種增殖相關(guān)細(xì)胞因子研究的GL15細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[14]。

1.3 SUMO蛋白質(zhì)修飾化CAMP2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響的觀察 將GL15細(xì)胞分為pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組及空白對(duì)照組。將pCMV質(zhì)粒載體與人CRMP-2全長(zhǎng)編碼混合；使用Q5?定點(diǎn)誘變?cè)噭┖型ㄟ^定點(diǎn)誘變誘導(dǎo)突變的核苷酸，構(gòu)建pCMV-CRMP2-K374A，使得細(xì)胞被SUMO蛋白質(zhì)修飾化能力下降。pCMV-CRMP2為陽性對(duì)照。pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對(duì)照組分別使用Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染pCMV-CRMP2、pCMV-CRMP2-K374A及pCMV質(zhì)粒載體。pCMV-CRMP2、pCMV-CRMP2-K374A、空白對(duì)照組CAMP2相對(duì)表達(dá)量分別為1.18±0.067、1.21±0.071、0.81±0.043，pCMV-CRMP2組和pCMV-CRMP2-K374A組細(xì)胞中CAMP2表達(dá)均高于空白對(duì)照組(P均<0.05)。使用EdU(25 μg/mL)孵育細(xì)胞4 h后，甲醇固定細(xì)胞5 min，用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌。紅色熒光AlexaFluor?594疊氮化物用于顯示結(jié)合的EdU，DAPI染核。蔡司顯微鏡下觀察并采集圖像，使用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.4 Ucb9介導(dǎo)CAMP2的SUMO蛋白質(zhì)修飾化對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖影響的觀察 將GL15細(xì)胞分為對(duì)照組及Ucb9組，Ucb9組使用Lipofectamine2000試劑將Ucb9類似物t-CSM肽20 μmol/L轉(zhuǎn)入GL15細(xì)胞，對(duì)照組轉(zhuǎn)入同等量0.01%二甲基亞砜。提取兩組總蛋白，采用Western blotting法檢測(cè)Ucb9、CRMP2蛋白，對(duì)照組、Ucb9組細(xì)胞中CAMP2相對(duì)表達(dá)量分別為0.80±0.046、0.78±0.045，Ucb9相對(duì)表達(dá)量分別為0.64±0.040、1.05±0.061，Ucb9組細(xì)胞中Ucb9表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。方法同“1.3”。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ucb9、CRMP2、CUMO蛋白質(zhì)修飾化CRMP2表達(dá)情況 GL15、A172、U87細(xì)胞中均表達(dá)Ucb9、CRMP2、SUMO蛋白質(zhì)修飾化CRMP。3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞CRMP2、Ucb9U表達(dá)由高到低依次為U87、GL15、A172細(xì)胞，兩兩相比，P均<0.05。見圖1、表1。GL15、A172、U87細(xì)胞中CRMP2與Ucb9表達(dá)均呈正相關(guān)(r分別為0.87、0.79、0.81，P均<0.05)，SUMO蛋白質(zhì)修飾化CAMP2與Ucb9表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.76、0.80、0.77，P均<0.05)。

圖1 GL15、A172、U87細(xì)胞中CRMP2、Ucb9及SUMO蛋白質(zhì)修飾化CAMP2表達(dá)情況(Western blotting法)

表1 GL15、A172、U87細(xì)胞中CRMP2、Ucb9及SUMO蛋白修飾化CRMP2表達(dá)情況

2.2 SUMO蛋白修飾化CRMP2對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對(duì)照組細(xì)胞增殖能力分別為1.53±0.052、0.98±0.023、0.96±0.024。pCMV-CRMP2組細(xì)胞增殖能力高于pCMV-CRMP2-K374A組及空白對(duì)照組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 pCMV-CRMP2組、pCMV-CRMP2-K374A組、空白對(duì)照組細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)

2.3 Ucb9介導(dǎo)CRMP2的SUMO蛋白修飾化對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 Ucb9組、對(duì)照組細(xì)胞增殖能力分別為1.65±0.063、0.91±0.031，Ucb9組細(xì)胞增殖能力高于對(duì)照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Ucb9組、對(duì)照組細(xì)胞增殖情況(CCK-8法)

3 討論

膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的顱內(nèi)惡性腫瘤，因其放化療耐受、浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、無限增殖的特性，使其成為惡性程度最高的腫瘤之一。如何有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲是膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。研究表明，轉(zhuǎn)錄后修飾，尤其是磷酸化和SUMO蛋白修飾化，賦予CRMP2在神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路的能力。針對(duì)CRMP2磷酸化在惡性腫瘤中作用的研究結(jié)果顯示，CRMP2基因絲氨酸522位點(diǎn)被CDK5磷酸化是GSK3B進(jìn)一步磷酸化和SUMO蛋白修飾化所必需的，CRMP2磷酸化和蛋白修飾化可協(xié)同誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞增殖[15,16]。有學(xué)者使用序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)分析，鑒定了CRMP2基因的賴氨酸374位點(diǎn)的SUMO蛋白修飾化點(diǎn)。有研究證明，Cdk5可使四聚體解體成單體，從而暴露SUMO蛋白修飾化位點(diǎn)。CRMP2在神經(jīng)元極性、神經(jīng)突向外生長(zhǎng)、軸突導(dǎo)向、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)元細(xì)胞死亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。Rho相關(guān)蛋白激酶將CRMP2磷酸化，可抑制CRMP2結(jié)合微管蛋白異二聚體的能力，從而導(dǎo)致微管去穩(wěn)定化，最終使軸突生長(zhǎng)，因此，它被認(rèn)為是阿爾茨海默病的潛在治療靶點(diǎn)。有研究表明，CRMP2的SUMO蛋白修飾化可以調(diào)節(jié)兒茶酚胺A分化細(xì)胞的鈉電流和NaV1.7轉(zhuǎn)運(yùn)，阻斷CRMP2蛋白修飾化可降低NaV1.7鈉電流，減輕神經(jīng)性疼痛[17-19]。

本研究旨在探討SUMO蛋白質(zhì)修飾化CAMP2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)變化及對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞CRMP2、Ucb9表達(dá)由高到低依次為U87、GL15、A172細(xì)胞，考慮表達(dá)差異與不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性程度有關(guān)。3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CRMP2表達(dá)與Ucb9含量呈正相關(guān)，驗(yàn)證Ucb9對(duì)CRMP2有SUMO蛋白修飾化作用。本研究選取GL15細(xì)胞進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)研究，采取構(gòu)建質(zhì)粒載體及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法制備不同組別GL15細(xì)胞進(jìn)行研究。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單純CAMP2表達(dá)升高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力較空白對(duì)照組明顯升高，但當(dāng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞CRMP2的SUMO蛋白修飾化位點(diǎn)發(fā)生突變后其增殖活性下降。這些結(jié)果表明，CRMP2及其SUMO蛋白修飾化在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中起到了一定作用。

Ubc9是一種E2 SUMO綴合酶，可介導(dǎo)CRMP2的SUMO蛋白修飾化[20]。我們假設(shè)，通過靶向調(diào)節(jié)Ucb9進(jìn)而調(diào)節(jié)CRMP2的SUMO蛋白修飾化是膠質(zhì)瘤潛在的治療策略。本研究采取細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法制備Ucb9表達(dá)明顯升高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，進(jìn)一步的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ucb9表達(dá)升高后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力也明顯增強(qiáng)，表明Ucb9介導(dǎo)的CRMP2 SUMO蛋白修飾化在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖中起到正性作用。

綜上所述，CRMP2及其SUMO蛋白修飾化在膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為中存在協(xié)同作用。CRMP2及其SUMO蛋白修飾化可介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，通過調(diào)節(jié)CRMP2表達(dá)或使其SUMO蛋白修飾位點(diǎn)突變，可改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性。以往研究結(jié)果顯示，CRMP2在惡性腫瘤細(xì)胞中普遍表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖，磷酸化可使這一作用增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Ucb9介導(dǎo)的CRMP2 SUMO蛋白修飾化使得磷酸化CRMP2的生物學(xué)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，從而驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。以上結(jié)果進(jìn)一步闡述了膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，通過靶向抑制CRMP2 SUMO蛋白修飾化有望成為膠質(zhì)瘤治療的新策略。