楊麗麗，張瓊文，張其偉，陳 婷，江明生

(廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530000)

0 引言

環(huán)狀RNA是從lncRNA分離出的一種新的非編碼RNA，在真核生物中高度表達。環(huán)狀RNA的結構極其穩(wěn)定，不同于lncRNA、miRNA的結構，lncRNA、miRNA具有游離的5′端帽子結構和 3′端 Poly(A)尾巴結構，而circRNA是5′端和3′端連接在一起，形成一個環(huán)狀RNA。通過mRNA前體剪接形成，由內(nèi)含子或外顯子或內(nèi)含子-外顯子環(huán)化產(chǎn)生，不同的環(huán)化方式，其功能作用不同。在后生動物中，環(huán)狀RNA以組織特異性的方式表達。過去的幾十年，環(huán)狀RNA被認為是剪接的副產(chǎn)品，無任何價值、沒有功能作用。但近10年來的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA不但有用，而且在生物體中參與生物體的各種生命活動，如參與機體的正常生理活動、Wnt信號通路、機體代謝通路的調(diào)控，發(fā)揮著重要作用。最近幾年，隨著RNA測序技術的發(fā)展，生物信息學工具的出現(xiàn)、不斷更新、完善，環(huán)狀RNA進入RNA的研究前沿，環(huán)狀RNA的研究越來越多。

1 環(huán)狀RNA的生物學特性

1.1 環(huán)狀RNA的起源

1976年，sanger和他的同事在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA[1]。1992年，在人類中發(fā)現(xiàn)競爭性內(nèi)源RNA，被稱為雜化外顯子[2]。1993年，Cocquerelle和他的同事研究確定了將這種帶有雜化外顯子的非聚腺苷化RNA確定為共價封閉環(huán)狀RNA，同時研究還證明環(huán)狀RNA定位于細胞質(zhì)中[3]；同年Capel的研究表明環(huán)狀RNA主要在細胞質(zhì)中，具有組織特異性[4]。2010年開始，隨著RNA測序技術的發(fā)展和生物信息學工具的出現(xiàn)，circRNA的研究進入前沿。2010年的幾項研究表明，數(shù)千種環(huán)狀RNA在后生動物中表達[5-8]，盡管大多數(shù)circRNA表達水平低，但有些卻很豐富。20世紀90年代，在高等真核生物中表達的第一個內(nèi)源性環(huán)狀RNA才被鑒定出來[9]。隨著高通量RNA測序技術的進一步發(fā)展，顯示環(huán)狀RNA廣泛表達于各種生物體、發(fā)育階段和組織中[5-7，10]。

1.2 環(huán)狀RNA的形成機制

環(huán)狀RNA是一類共價閉合環(huán)狀RNA。1987年，Price和他的同事的研究發(fā)現(xiàn)circRNA通過反向剪接將下游5′端剪接位點連接到上游3′端位點[11]，形成環(huán)狀RNA。隨后，Kjems的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA是由單細胞真核生物中的剪接內(nèi)含子和古菌中的核糖體內(nèi)含子產(chǎn)生的[12]。2016年2月份，有研究表示真核細胞中的circRNA來源于mRNA前體(pre-mRNA)的反向剪接而成。與線性剪接相比，反向剪接的剪接效率慢[13]。2017年，Piwecka M和Conn VM的研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的產(chǎn)生通常是由內(nèi)含子重復序列促進的，內(nèi)含子重復序列彼此堿基配對，使插入的剪接位點接近[14，15]，這類環(huán)狀RNA為內(nèi)含子環(huán)狀RNA[16]。之后，有相關研究報道，包括Quaking 1(QKI)、muscleblind(MBL)、FUS和nuclear factor 90(NF90)在內(nèi)的RBPs通過與側位內(nèi)含子結合配對，促進外顯子序列的循環(huán)[17]，這類環(huán)狀RNA為外顯子環(huán)狀RNA[7]。Zhang等人最近的一項研究表明，備用的5′供體剪接位點和3′受體剪接位點可以從單個基因座產(chǎn)生多個環(huán)狀RNA[18]，這類環(huán)狀RNA為外顯子-內(nèi)含子(EI)環(huán)狀RNA[19]。

2 環(huán)狀RNA基本功能

早前研究，發(fā)現(xiàn)了大量環(huán)狀RNA。最初，研究者發(fā)現(xiàn)其是剪接的副產(chǎn)品，被認為是無功能的。隨著RNA-seq和生物學信息的發(fā)展，越來越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)具有潛在功能，最近的研究證明環(huán)狀RNA在生物機體、后生動物中起多種作用。環(huán)狀RNA主要有以下4種基本功能。

2.1 作為競爭性內(nèi)源RNA

通過結合miRNA而抑制miRNA的功能。環(huán)狀RNA中存在miRNA的多個結合位點，存在競爭關系，調(diào)控miRNA下游靶基因的表達。2016年，yang和他的同事研究表明，ciRS-7具有miR-7的74個miRNA結合位點，當ciRS-7過表達時，能大量結合miR-7而導致miR-7靶基因表達水平上升，相反，抑制ciRS-7的表達時，miR-7靶基因表達水平降低[20，21]。這個例子就很好地證明circRNA具有多個miRNA的結合位點，同時能調(diào)節(jié)多個miRNA的活性。

2.2 轉錄和剪接的調(diào)節(jié)因子

在細胞核內(nèi)參與轉錄調(diào)控，通過與mRNA異構體競爭性剪切從而調(diào)控線性mRNA的表達水平[22]。研究報道，Ci-ANKRD52和ci-SIRT7可以通過與RNA PoI II相互作用調(diào)控轉錄水平[23]。Li的研究結果證實單個基因座產(chǎn)生的環(huán)狀RNA為外顯子-內(nèi)含子(EI)環(huán)狀RNA或EIciRNA，EIciRNA主要位于細胞核內(nèi)，Shan等人研究證明，EIciRNA在細胞核中，與U1 snRNP相互作用并促進其親本基因的轉錄[24]。

2.3 與RNA結合蛋白結合

研究報道，環(huán)狀RNA可以與某些RNA結合蛋白，作為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互調(diào)節(jié)的支架分子影響蛋白的表達[25]，從而調(diào)控蛋白的功能。有研究證明，circ-Foxo3可結合NDM2和p53，促進p53泛素化修飾和降解，導致細胞PUMA上調(diào)增加細胞凋亡敏感性[26]；circ-Foxo3通過與細胞周期蛋白依賴性激酶2(也稱為細胞分裂蛋白激酶2或CDK2)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(或p21)結合而抑制了細胞周期進程三元復合體。CDK2與細胞周期蛋白A和細胞周期蛋白E相互作用以促進細胞周期進入，而p21則抑制這些相互作用并阻止細胞周期進程[27]。

2.4 環(huán)狀RNA具有編碼潛能

早期研究報道，環(huán)狀RNA不能翻譯蛋白。但隨著技術的發(fā)展，有研究證明具有核糖體進入位點序列(IRES)的circRNA具有編碼潛能，環(huán)狀RNA通過與核糖體相互作用，參與蛋白的翻譯。2017年，Legnini的研究表明，circ-ZNF609可以翻譯蛋白并調(diào)控肌肉發(fā)育，Circ-ZNF609包含一個從起始密碼子開始的可讀框，與線性轉錄本相同，并終止于在環(huán)化過程中創(chuàng)建的幀內(nèi)STOP密碼子，circ-ZNF609與重鏈多核糖體相關，并以剪接依賴性和帽依賴性的方式翻譯成蛋白質(zhì)[28]。2017年Pamudurti的研究證實circ-Mb1可以翻譯蛋白質(zhì)，2018年陳雅露的文章提到的研究結果證實circ-FBXW7具有翻譯功能[29]。

3 環(huán)狀RNA調(diào)控動物肌肉發(fā)育

已有多項研究報告了環(huán)狀RNA在醫(yī)學疾病、肌肉發(fā)育中的生物學功能，環(huán)狀RNA可以結合miRNA而抑制miRNA的功能，即環(huán)狀RNA可海綿化miRNA；環(huán)狀RNA可以在細胞核內(nèi)，調(diào)控mRNA的表達水平；環(huán)狀RNA也可以調(diào)控蛋白，通過與RNA結合蛋白結合，影響蛋白結構；環(huán)狀RNA具有編碼功能，但是，相關研究報道較少。在動物肌肉發(fā)育中研究較多的是環(huán)狀RNA的競爭性內(nèi)源作用。

3.1 circ RNA-RBFOX2、circSVIL、 circFGFR2調(diào)控雞肌肉發(fā)育

為了探究circRNA雞骨骼肌發(fā)育中的機制，Ouyang 等[30，31]對雞3個發(fā)育時期(胚胎11 d，胚胎16 d和出生后1 d)腿肌的circ RNAs進行轉錄組測序分析，共鑒定13，377個circ RNAs，其中3，036個表達豐度較高，462個呈顯著性差異表達，在946個外顯子circ RNAs中發(fā)現(xiàn)有150個已知的miRNA的結合位點。進一步分析 circ RNA -RBFOX2和circSVIL在雞骨骼肌中的調(diào)控作用。circ RNA -RBFOX2具有miR-206和miR-1a-3p的結合位點。通過雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在circ RNA -RBFOX2存在的條件下，miR-206和miR-1a-3p敲低能力顯著下降，接著通過circ RNA -RBFOX2過表達或敲低，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，circ RNA -RBFOX2過表達，miR-206和miR-1a-3p的表達水平下降，反之上升。為了進一步驗證circ RNA -RBFOX2是否調(diào)控miR-206的靶基因，根據(jù)軟件預測，熒光素酶檢測，CCND2定為miR-206的靶基因。最后通過過表達敲低，發(fā)現(xiàn)CCND2是miR-206的靶點，并且隨著circ RNA -RBFOX2過表達而上升。circSVIL來源于雞2號染色體上SVIL外顯子6-14，Ouyang研究發(fā)現(xiàn)CircSVIL在雞的胚胎發(fā)育后期高表達，circSVIL有4個miR-203的結合位點，通過雙熒光素酶報告試驗驗證了circSVIL與miR-203的相互作用[31]。結果證明，circSVIL通過使miR-203海綿化并增加靶標c-JUN和MEF2C的表達來促進成肌細胞增殖和分化?？傊琧ircSVIL通過螯合雞中的miR-203來促進胚胎骨骼肌的發(fā)育，circ RNA -RBFOX2通過海綿化miR-206增強CCND2的表達，促進了雞成肌細胞的增值。以上研究為環(huán)狀RNA在雞育種調(diào)控機制中提供了新的理論知識。

circFGFR2是由FGFR2外顯子3-6產(chǎn)生的基因，在雞胚骨骼肌發(fā)育中差異表達。為了解circFGFR2是如何影響雞骨骼肌發(fā)育的機制。Chen等[32]人通過細胞周期的流式細胞術分析和EdU分析來分析細胞增殖，通過分析分化標志物基因的表達和肌球蛋白重鏈(MyHC)免疫熒光來確定細胞分化。流式細胞儀分析細胞周期和EdU分析的結果表明，circFGFR2的過表達加速了成肌細胞和QM-7細胞的增殖，而用siRNA敲除circFGFR2則降低了這2種細胞的增殖。同時，circFGFR2的過表達加速了肌原性分化1(MYOD)，肌生成素(MYOG)和肌管的形成以及circFGFR2的敲低在成肌細胞中顯示出相反的作用。熒光素酶報告基因檢測和生物素偶聯(lián)的miRNA下拉檢測的結果進一步表明，circFGFR2可以直接靶向miR-133a-5p的兩個結合位點和miR-29b-1-5p的一個結合位點，并進一步抑這兩個miRNA。此外，有研究證實，miR-133a-5p和miR-29b-1-5p均抑制成肌細胞的增殖和分化，而circFGFR2可以消除兩個miRNA的抑制作用。綜上，circFGFR2通過使miR-133a-5p和miR-29b-1-5p海綿化，可以促進骨骼肌的增殖和分化。

3.2 circFGFR4、circFUT10、circLMO7、circTTN調(diào)控牛肌肉發(fā)育

Li等[33，34]分析了秦川牛胚胎時期和成年時期牛肌肉組織中差異表達的circFGFR4、circFUT10。為了探究其在肌肉中的調(diào)控機制，通過TargetScan 和RNAhybird軟件預測circFGFR4、circFUT10的靶向基因miR-107、miR-133a，雙熒光素酶報告實驗檢測其相互作用，實時熒光定量和WB檢測表達量，觀察到circFGFR4海綿miR-107，circFGFR4的過度表達增加了Wnt3a的表達，而這種效應被miR-107所消除；circFUT10通過直接結合miR-133a和抑制miR-133a的活性來調(diào)節(jié)成肌細胞的分化和細胞存活。綜上，circFUT10、circFGFR4的表達在肌肉組織中的調(diào)節(jié)可能成為控制牛肌肉發(fā)育的育種策略的潛在目標。

Wei[35]為了探究circLMO7在牛肌肉發(fā)育中的功能，對其進行了鑒定分析。首先通過實時熒光定量PCR檢測了circLMO7在不同組織中的表達，構建了組織表達譜，發(fā)現(xiàn)circLMO7在背肌中表達量最高。接著探究了circLMO7在肌肉發(fā)育中的功能機制，發(fā)現(xiàn)circLMO7的過度表達抑制了牛原代成肌細胞的分化，它似乎是miR-378a-3p的競爭性內(nèi)源性RNA，MiR-378 a-3p參與牛肌肉發(fā)育的作用已被預先表征。這與研究者預期的結果一致，circLMO7在細胞周期的S期增加了成肌細胞的數(shù)量，在G0/G1期減少了細胞的比例。此外，它促進成肌細胞的增殖并保護它們免于凋亡。這項研究為骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機制提供了新的見解，并確定了一些未來需要探索其調(diào)控潛力的環(huán)狀RNA。

2019年，Xiaogang Wang[36]證明了circTTN在牛原代成肌細胞中的作用和調(diào)控機制。他們的研究首次確定了circTTN通過與miR-432作為ceRNA競爭來調(diào)節(jié)牛成肌細胞的增殖和分化，從而激活IGF2/PI3K/AKT信號通路。circTTN過表達促進牛原代成肌細胞增殖，干擾circTTN表達時，促進牛原代成肌細胞分化。通過熒光素酶篩選和RNA免疫沉淀(RIP)分析，證實了circTTN與miR-432的相互作用。定量實時聚合酶鏈反應和蛋白質(zhì)印跡分析，結果發(fā)現(xiàn)miR-432表達的增加抑制了IGF2的表達，但這種作用被circTTN所緩解。

3.3 circTUT7調(diào)控豬肌肉發(fā)育

Hong L等研究了杜洛克豬在性交后第33、65和90 天胚胎肌肉發(fā)育中circRNA表達[37]。分析表明circRNA在胚胎肌肉發(fā)育中特異性表達。對circRNA的競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡分析表明，circRNA調(diào)節(jié)肌肉通過充當miRNA海綿來表達基因，circTUT7在ceRNA機制中調(diào)節(jié)HMG20B的表達。試驗表明，circRNAs是動態(tài)表達，并通過ceRNA方式與肌肉基因相互作用，提示其在胚胎骨骼肌發(fā)育中的關鍵功能。

3.4 circPAPD、circQKI調(diào)控羊肌肉發(fā)育

趙薇博士[38]在山羊背最長肌6個發(fā)育時期鑒定出了14 655個circRNA，6 276個circRNA在6個發(fā)育階段共表達，有1 336個circRNA在不同發(fā)育階段兩兩之間存在顯著性差異。通過RT-PCR和qPCR驗證了RNA-seq得到的circRNA的環(huán)化位點和表達量，證實了測序的可靠性。通過靶基因預測發(fā)現(xiàn)與circRNA結合的miRNA包含miR-1、miR-206和miR-133等肌肉特異性的miRNA，說明circRNA可作為miRNA的分子海綿參與肌肉發(fā)育過程，利用GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，circPAPD7、circQKI參與細胞增殖分化過程。為進一步研究其功能，通過構建過表達載體和siRNA載體對其進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)，在SMSCs中過表達circPAPD7能極顯著上調(diào)增殖相關基因PCNA、Pax7以及miR-26a-5p靶基因EZH2的表達并促進細胞增殖，同時過表達circPAPD7顯著下調(diào)成肌分化相關基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和miR-26a-5p的表達并抑制肌管形成；抑制circPAPD7的表達則導致增殖相關基因及EZH2的表達下調(diào)并抑制細胞增殖，同時成肌分化相關基因及miR-26a-5p的表達上調(diào)且肌管數(shù)增多。通過AgO2-RIP實驗進一步驗證circPAPD7、miR-26a-5p及EZH2可通過ceRNA機制促進山羊SMSCs的增殖并抑制分化。過表達circQKI后增殖相關基因PCNA和Pax7、成肌分化相關基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和來源基因QKI的表達均極顯著上調(diào)并促進細胞增殖以及肌管的形成；抑制細胞內(nèi)源性circQKI的表達后，上述增殖、分化基因及來源基因QKI的表達均下調(diào)，同時新增細胞核及肌管數(shù)目減少。試驗證明可通過上調(diào)circQKI基因的表達促進山羊SMSCs的增殖和分化。

4 發(fā)展前景

2010年起，RNA測序技術的進步，生物信息學方法的完善，大量環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，被收入數(shù)據(jù)庫，意味著環(huán)狀RNA的研究有了新的發(fā)展，而不是被認為無功能的剪接副產(chǎn)品。近幾年，環(huán)狀RNA的功能被越來越多的研究者探討、研究，且研究成果證明環(huán)狀RNA具有ceRNA機制、結合功能蛋白、m6A修飾、編碼潛能等功能。目前，環(huán)狀RNA的研究主要集中于醫(yī)學中疾病的研究，尤其腫瘤癌癥，如乳腺癌、大腸癌、胃癌、橫紋肌肉腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，但在動物肌肉發(fā)育的研究很少，且有些發(fā)現(xiàn)的、鑒定的circRNA功能機制仍不清楚，需進一步探討、研究。在畜禽中發(fā)現(xiàn)新的circRNA，探索其功能機制，將會為分子生物學在動物肌肉的生長發(fā)育研究提供一些新的資源和線索，為畜牧業(yè)提供一個新的發(fā)展領域，促進畜牧業(yè)的發(fā)展。