卜晨琛，劉學(xué)良，劉亞蓉，宋 霞，韓曉萍

（青海省藥品檢驗檢測院/青海省中藏藥現(xiàn)代研究重點實驗室，青海西寧 810000）

復(fù)方金銀花顆粒由金銀花、連翹、黃芩等三味藥材組成，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，用于風(fēng)熱感冒，咽炎，扁桃體炎，目痛，牙痛及癰腫瘡癤[1]。

復(fù)方金銀花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)最早收載于《衛(wèi)生部中藥成方制劑》第十冊標(biāo)準(zhǔn)編號WS3-B-1985-95，收載項目簡單，無法全面控制藥品質(zhì)量，大部分生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。其他企業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-1985-95-7，WS3-B-1985-95-6，WS3-B-1985-95-8，WS3-B-1985-95-4[1]。

國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上顯示復(fù)方金銀花顆?，F(xiàn)有生產(chǎn)廠家為33家，批準(zhǔn)文號33個，劑型為顆粒劑。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)較落后，不夠全面，有必要加強其質(zhì)量控制，提高現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，以保證其臨床療效和安全性。本研究依托國家藥典委員會，提高和完善了復(fù)方金銀花顆粒的標(biāo)準(zhǔn)，可全面控制其質(zhì)量[2-6]。

1 材料

1.1 樣品收集情況

此次研究共收集到15家生產(chǎn)企業(yè)的樣品23批次，覆蓋全國近50%的復(fù)方金銀花顆粒的生產(chǎn)企業(yè)，15家生產(chǎn)企業(yè)均提供了處方中藥材原料。經(jīng)青海省藥品檢驗檢測院鑒定，所有原藥材的基源與處方一致，均為《中國藥典》2015年版一部中的收載品種。

1.2 儀器與試藥

卡瑪全自動點樣儀(型號：LINOMAT 5)，超聲波清洗器（型號：B2500s-MT），Agilent 1260高效液相色譜儀，Waters2695高效液相色譜儀，METTLER TOLEDO XS105DU 電子天平。高效硅膠G薄層板（默克化工），聚酰胺薄膜（路橋四甲生化塑料廠），乙睛為色譜純，其余試劑均為分析純。對照藥材、對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，連翹（120908-200914）、黃芩（120955-201008）、金銀花（121060-201107）、連翹苷（110821-200610）、黃芩苷（715-200111）、綠原酸（110753-200413）。

2 實驗方法

2.1 性狀

按23批次復(fù)方金銀花顆粒的實際情況進(jìn)行描述：本品為淺黃色至黃棕色的顆粒；味甜，微苦。

2.2 復(fù)方金銀花顆粒中金銀花、連翹、黃芩的薄層色譜鑒別

2.2.1 金銀花、綠原酸的薄層色譜 取樣品約5g，研細(xì)，加甲醇20ml，超聲20min，取濾液作為供試品溶液。取金銀花對照藥材約0.5g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液。取綠原酸對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7:2.5:2.5）的上層溶液為展開劑，展開后，置紫外燈（365nm）下檢視。

2.2.2 連翹、連翹苷的薄層色譜 取鑒別2.2.1項下的供試液，取濾液10ml，濃縮至2ml，作為供試品溶液。取連翹對照藥材約0.5g，加甲醇10ml，同法制成對照藥材溶液。取連翹苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（10:1:0.5）為展開劑，展開后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

2.2.3 黃芩、黃芩苷的薄層色譜 取鑒別2.2.2項下的供試液，作為供試品溶液。取黃芩對照藥材約0.5g，加甲醇10ml，超聲處理10min，取濾液作為對照藥材溶液。取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的對照品溶液。吸取上述溶液各2～5μl，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸為展開劑，展開后，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，0.4%磷酸為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫（0～13min，A:10%,B:90%;13～15min，A:10%→29%，B:90%→71%；35～37min，A:29%，B:71%；37～42min，A:29%→25%，B：71%→75%）；流速為1.0ml/min；綠原酸檢測波長為326nm，連翹苷、黃芩苷檢測波長為278nm。理論塔板數(shù)數(shù)按黃芩苷計，不得低于6000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取對照品適量，加50%甲醇配置成每1 ml含綠原酸0.04974 mg、含連翹苷0.01969 mg、含黃芩苷0.1233 mg的混合對照品。

2.3.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方金銀花顆粒約2 g，精密稱定，置具塞錐瓶中，精密加入50%甲醇25 ml，稱定重量，超聲（功率250 w，頻率35 kHz）處理30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)驗證 ⑴ 成分選擇：由文獻(xiàn)可知金銀花中綠原酸含量最高，且為有效成分之一[7-8]；連翹中連翹苷為有效成分之一，且含量較高[9-10]；黃芩中黃芩苷含量最高，且為有效成分之一[11-12]。由《中國藥典》2015年版中可知，金銀花中含綠原酸（C16H18O9）不得少于1.5%，流動相為（乙腈-0.4%磷酸溶液）[13]；連翹含連翹苷（C27H34O11）不得少于 0.15%，流動相為（乙腈-水）[14]；黃芩飲片含黃芩苷（C21H18O11）不得少于8.0%，流動相為（甲醇-0.2%磷酸）[15]。三種藥材在極性差不多的流動相條件下，含量限度大小分別為黃芩苷＞綠原酸＞連翹苷。⑵色譜柱及儀器的考察：選用 Agilent ZORBAX SB色譜柱（4.6 mm×250 mm）、BOS Chrom ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm），分別在 Agilent1260高效液相色譜儀、Waters2695高效液相色譜儀均能得到很好的分離。⑶ 線性關(guān)系考察：取2.3.2項下混合對照品溶液2、4、8、12、20μl，按上述條件分別注入色譜儀測定，以進(jìn)樣量對峰面積進(jìn)行回歸。綠原酸在0.09948～0.9948μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；連翹苷在0.0398～0.3938μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；黃芩苷在0.2466～2.466μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。⑷ 精密度考察：取2.3.2項下混合對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量10μl，RSD值均小于2%，表明本方法精密度良好。⑸ 穩(wěn)定性試驗：取2.3.3項下供試品溶液（批號20160316），分別在0、4、8、12、24小時進(jìn)樣，進(jìn)樣量10μl，綠原酸、連翹苷、黃芩苷的 RSD（relative standard deviation，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）值均小于2%，表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。⑹ 重現(xiàn)性試驗：取2.3.3項下供試品溶液（批號151102）5份，進(jìn)樣量10μl，并分別計算出綠原酸、連翹苷、黃芩苷的含量，RSD值均小于2%，表明本方法重現(xiàn)性良好。⑺ 加樣回收率試驗：取樣品（批號151102）6份，每份取1g，精密稱定，精密加入一定量的綠原酸、連翹苷、黃芩苷對照品，按2.3.3項下的制備方法制備，依法測定，計算加樣加收率，平均回收率在101%～103%之間。

3 實驗結(jié)果

本實驗建立的TLC法，可鑒別出復(fù)方金銀花顆粒中的金銀花、黃芩、連翹，各展開系統(tǒng)對樣品的分離度良好，特征斑點明顯，陰性無干擾。

23批樣品中，綠原酸測定結(jié)果在0.2～19.5mg/袋之間，平均值為5.6mg/袋，按平均值的60%暫定限度為本品每袋含綠原酸不得少于3.3mg，7批樣品低于限度值。黃芩苷測定結(jié)果在0.3～85.4 mg/袋之間，平均值為14.2 mg/袋，按平均值的60%暫定限度為本品每袋含黃芩苷不得少于8.0 mg/袋，5批樣品低于限度值。連翹苷測定結(jié)果在0.7～13.1mg/袋之間，但由色譜圖所示，黃芩苷的峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于連翹苷，保留時間相近，且連翹苷的含量約為黃芩苷的含量的七分之一，所以不在標(biāo)準(zhǔn)中列出連翹苷的含量。23批樣品中綠原酸、黃芩苷含量均合格的12批，合格率為52%。

4 原標(biāo)準(zhǔn)中的理化鑒別與薄層色譜鑒別驗證

4.1 理化鑒別

原標(biāo)準(zhǔn)方法《衛(wèi)生部中藥成方制劑》第十冊標(biāo)準(zhǔn)編號WS3-B-1985-95中鑒別（1）[1]。依據(jù)實際實驗，樣品雖加入活性炭處理，但本身的黃色干擾依舊嚴(yán)重，所以新標(biāo)準(zhǔn)中刪除。

4.2 黃芩的薄層色譜

原標(biāo)準(zhǔn)方法《衛(wèi)生部中藥成方制劑》第十冊標(biāo)準(zhǔn)編號WS3-B-1985-95中鑒別（2）[1]。因?qū)φ账幉呐c樣品處理方法不一致，操作較繁瑣，且新的黃芩TLC方法可行性良好，所以刪除。

5 討論

復(fù)方金銀花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)最早收載于《衛(wèi)生部中藥成方制劑》第十冊標(biāo)準(zhǔn)編號WS3-B-1985-95。收載項目有【性狀】、【鑒別】（理化鑒別，黃芩的TLC鑒別）、【檢查】，無法全面控制藥品質(zhì)量。大部分生產(chǎn)企業(yè)執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。

其他企業(yè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有，洛陽君山制藥有限公司執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-1985-95-7，廣州諾金制藥有限公司執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-1985-95-6，哈爾濱大洋制藥股份有限公司執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-1985-95-8，大慶華科股份有限公司藥業(yè)分公司執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS3-B-1985-95-4，雖然各企業(yè)執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)在原有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上有一定的完善，但都不夠全面。

此次研究對復(fù)方金銀花顆粒的生產(chǎn)、市場流通情況和所用藥材進(jìn)行了調(diào)研，最終根據(jù)試驗結(jié)果的可行性，對原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范和調(diào)整。首先依據(jù)實際情況，修改原標(biāo)準(zhǔn)中的性狀項，使其更加符合實際生產(chǎn)出的產(chǎn)品性狀。其次，增加或修改了金銀花、黃芩苷和連翹的TLC鑒別項，使得TLC方法更加合理簡便，可鑒別出其中的三味藥材的真假。最后，增加或修改了含量鑒別項，可同時測定出綠原酸和黃芩苷的含量，可對其金銀花和黃芩的投入量進(jìn)行一個量的控制。

此次收集到的23批復(fù)方金銀花顆粒樣品，依據(jù)原標(biāo)準(zhǔn)檢驗，合格率為100%，用新的檢驗標(biāo)準(zhǔn)檢驗時，合格率僅為52%，分析原因，可能有部分廠家在生產(chǎn)時雖然加入了金銀花、連翹、黃芩三味藥材，但存在投料不足或者以次充好的現(xiàn)象，以致生產(chǎn)出的復(fù)方金銀花顆粒含量不合格，至于臨床療效是否有影響，需進(jìn)一步研究。本研究同時反映出原標(biāo)準(zhǔn)有所欠缺，此新的檢驗標(biāo)準(zhǔn)能夠更好、更全面地控制復(fù)方金銀花顆粒的質(zhì)量，能夠督促各個企業(yè)更加注重原料藥材的品質(zhì)，同時也可統(tǒng)一復(fù)方金銀花顆粒的標(biāo)準(zhǔn)（現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)共5個），為藥品檢驗人員提供了便利，本研究的新的標(biāo)準(zhǔn)的不足是不能控制連翹的投入量，需要進(jìn)一步研究。

建議今后藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，能夠全面科學(xué)地分析問題，從實際情況出發(fā)，嚴(yán)格制定。各企業(yè)要從嚴(yán)要求，良心投料，生產(chǎn)出質(zhì)量和品質(zhì)有保證的藥品[15]。