韓萱

（北京中學(xué)，北京 100018）

1 研究背景

西雙版納是我國(guó)現(xiàn)存面積最大的熱帶雨林地區(qū)，它位于中國(guó)云南省南部，地處北回歸線(xiàn)以南的熱帶北部邊沿，受印度洋、太平洋季風(fēng)氣候影響，終年溫暖、陽(yáng)光充足、濕潤(rùn)多雨，是中國(guó)熱帶雨林生態(tài)系統(tǒng)保存最完整、最典型的地區(qū)，也是當(dāng)今地球上少有的植物基因庫(kù)，被譽(yù)為地球的一大自然奇觀(guān)，是一個(gè)豐富多彩的“植物王國(guó)”。

蘭科植物藥用價(jià)值高，但對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，加之人們肆意破壞，現(xiàn)已成為瀕危物種。蘭科植物種類(lèi)繁多，大多數(shù)的蘭花樣品屬于石斛屬，許多種類(lèi)均是名貴的中藥材。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，“石斛”被列為上品，因此已造成掠奪性采挖，加上對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻，繁殖緩慢，自然更新能力差，而且僅在我國(guó)云南和廣西有大范圍的種植和栽培。

隨著人們保護(hù)環(huán)境、保護(hù)生物多樣性、保護(hù)瀕危物種意識(shí)的提高，蘭科植物的繁殖和栽培也已引起人們的重視，研究人員也在積極的探尋一種加快蘭科植物繁殖、改善其種植環(huán)境的新方法。蘭花喜濕潤(rùn)，忌漬澇。盆土水分過(guò)大，喜涼爽，忌高溫，喜陰，忌陽(yáng)光直射。

為了能培育蘭科植物并回歸自然，減少人力和財(cái)力的消耗，我們將通過(guò)使用TTC 染色法對(duì)選擇的金釵石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛、冬鳳蘭等四種常見(jiàn)的蘭科植物種子的活力進(jìn)行測(cè)定并選擇活力較高的蘭科植物種類(lèi)進(jìn)行培育，從而探究四種蘭科植物的繁殖能力和種植方法。希望能夠通過(guò)我們的研究加快培養(yǎng)蘭科植物的生長(zhǎng)速度。

2 研究目的

（1）了解真菌對(duì)蘭科植物萌發(fā)的影響；

（2）探究四種蘭科植物種子的繁殖能力及培育方法；

（3）提出合理科學(xué)地選擇并培育蘭科植物的建議。

3 研究方法

3.1 工具及儀器

潔凈工作臺(tái)、電熱鼓風(fēng)干燥箱、立式壓力蒸汽滅菌器、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、電子天平、電磁爐試、注射器、無(wú)紡布、載玻片、蓋玻片、蘭花瓶、鍋、純凈水、pH 試紙、玻璃棒、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、錐形瓶等。

3.2 材料及藥品

金釵石斛、竹枝石斛、鼓槌石斛和冬鳳蘭四種蘭科植物成熟種子、已萌發(fā)蘭科植物幼苗、蘭科植物菌根菌、TTC、4%次氯酸鈣溶液、1%吐溫80 溶液、純凈水、MS 母液、蔗糖、瓊脂、活性炭、土豆、葡萄糖、瓊脂。

3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.3.1 種子預(yù)處理

將從野外采集回來(lái)的種子放在干燥器里，去除種子表面的水分后裝進(jìn)收集管內(nèi)密封，并放入4℃冰箱保存。

3.3.2 TTC 染色法測(cè)定蘭花種子活力

將注射器頂端用45μm 孔徑的紗布封住，防止種子出來(lái)；將少許經(jīng)過(guò)預(yù)處理的蘭科植物種子放入注射器針管；將4%的次氯酸鈣和1%吐溫801:1 混合，用玻璃棒攪拌充分混合；用注射器抽進(jìn)7mL 混合液，排出空氣，振蕩均勻，靜置20min；排出混合液，抽進(jìn)純凈水，搖晃注射器，再排出純凈水，反復(fù)三次清洗；抽進(jìn)7～8mL 純凈水，放到陰涼處?kù)o置24h；將注射器中的純凈水排出，將少許TTC 倒進(jìn)小燒杯內(nèi)，用注射器吸入5～6mL，放入30℃電熱鼓風(fēng)干燥箱，靜置24h；染色畢，排出TTC，吸入至少6mL 的純凈水，振蕩注射器，排出純凈水反復(fù)三次，最后一次留下少許純凈水。

3.3.3 真菌培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）的配置與菌根菌的培養(yǎng)

準(zhǔn)備200g 左右的土豆一塊，洗凈、削皮、切塊，開(kāi)水煮30min；同時(shí)各量出20g 的葡萄糖和瓊脂，準(zhǔn)備培養(yǎng)皿，并使用滅菌鍋消毒；將土豆塊撈出，留下剩余液體，用四層紗布過(guò)濾至燒杯中，再用四層紗布將液體過(guò)濾到最大測(cè)量值大于等于1L 的量筒中，補(bǔ)充純凈水至1L；從量筒中倒出一部分液體與瓊脂混合，攪拌至糊狀。加入葡萄糖、瓊脂糊，加熱；將液體培養(yǎng)基分別倒入四個(gè)錐形瓶250mL，封口，用滅菌鍋滅菌；用超凈工作臺(tái)給培養(yǎng)皿紫外線(xiàn)滅菌，點(diǎn)燃酒精燈，將蘭花培養(yǎng)基從滅菌鍋中取出，用酒精燈加熱錐形瓶瓶口消毒，將液體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，厚度為4mm 左右，以此類(lèi)推，直至加工完所有液體培養(yǎng)基。等待所有PDA 培養(yǎng)基冷卻凝固；用酒精燈加熱接種針消毒，直至燒紅，靜置冷卻。用接種針剜下一小塊蘭花的菌根菌，放到培養(yǎng)皿正中間；合閉培養(yǎng)皿，加熱邊緣消毒，用保鮮膜包裹2～3 圈，以此類(lèi)推，加工完所有培養(yǎng)基。放入培養(yǎng)箱，等待萌發(fā)。

3.3.4 蘭花培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基）的配制與蘭花苗的移植

加入工作液：大量元素、氯化鈣水各200mL，微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽各加10mL；純凈水定容至2L，煮沸。添加蔗糖50g、瓊脂16g、黑炭2g，攪拌均勻，煮沸；將液態(tài)培養(yǎng)基分別倒入32 個(gè)培養(yǎng)罐內(nèi)，深度在1cm 左右。等待培養(yǎng)基冷卻、凝固；將蘭花培養(yǎng)基放入超凈工作臺(tái)半小時(shí)紫外線(xiàn)滅菌。將鑷子放入327℃左右的接種器械滅菌器滅菌，取出長(zhǎng)滿(mǎn)石斛幼苗的培養(yǎng)罐兩個(gè)；點(diǎn)燃酒精燈，用酒精燈加熱培養(yǎng)罐與MS 培養(yǎng)基罐罐口滅菌，并打開(kāi)罐蓋；加熱鑷子消毒，再將鑷子插入MS 培養(yǎng)基冷卻；用鑷子輕輕將石斛苗夾入MS 培養(yǎng)基，生長(zhǎng)點(diǎn)朝下，葉子朝上，每個(gè)MS 培養(yǎng)基罐放入4 個(gè)左右的苗，以此類(lèi)推，移植到全部32 個(gè)培養(yǎng)罐內(nèi)；操作完成后，鑷子用75%的酒精消毒后放回接種器械滅菌器。用保鮮膜包裹MS 培養(yǎng)基罐蓋子與罐身的接口處，纏2～3 圈，隔絕其他真菌；將全部培養(yǎng)罐整齊地?cái)[放在組培室架子上。

4 蘭科植物與真菌的關(guān)系

真菌與蘭花形成了一種共生的關(guān)系，真菌有助于蘭科植物對(duì)氮磷鉀等元素的吸收，也有文獻(xiàn)報(bào)道真菌能分泌激素，從而促進(jìn)蘭花的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基是根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象所需營(yíng)養(yǎng)配置的一種固態(tài)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，能為蘭花提供生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)，相當(dāng)于真菌的作用。蘭花自己會(huì)主動(dòng)找到適合的真菌，但用培養(yǎng)基培養(yǎng)蘭花省去了蘭花自己尋找真菌的不確定性，加快了萌發(fā)速度，讓蘭花長(zhǎng)得更好。雖然無(wú)菌培養(yǎng)已成為如今挽救蘭科植物必不可少的一個(gè)途徑，但其中卻仍存在著無(wú)菌苗易退化，移栽成活率低、病害嚴(yán)重等問(wèn)題。

5 結(jié)果分析

5.1 蘭科植物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻

據(jù)資料顯示，光照時(shí)間、溫度、濕度、是否通風(fēng)都會(huì)影響蘭花的生長(zhǎng)。當(dāng)光照不足時(shí)，蘭株軟弱徒長(zhǎng)；光照過(guò)強(qiáng)時(shí)，葉子會(huì)被曬黃或曬焦，失去觀(guān)賞價(jià)值甚至死亡。蘭花的栽培溫度隨著產(chǎn)地和品種的不同各不相同。種植蘭花的濕度要維持在80%以上，冬季為半休眠期，這時(shí)濕度可降至50%亦可。種植蘭花的場(chǎng)地必須要保持良好的通風(fēng)環(huán)境，在我們種植過(guò)程中，通過(guò)觀(guān)察發(fā)現(xiàn)蘭花苗在營(yíng)養(yǎng)條件較好的情況下生長(zhǎng)得十分旺盛，但這也會(huì)導(dǎo)致蘭花苗生長(zhǎng)過(guò)于集中而營(yíng)養(yǎng)不足而死。蘭花苗移植實(shí)驗(yàn)就是針對(duì)此情況來(lái)改變蘭花苗的生長(zhǎng)環(huán)境，使每株蘭花苗都能獲取到足夠的養(yǎng)分。

5.2 竹枝石斛的繁殖能力最強(qiáng)

從數(shù)據(jù)中可以看出，四種蘭花種子中，竹枝石斛種子的染色率，即種子的成活率最高，因此在冬鳳蘭、鼓槌石斛、金釵石斛和竹枝石斛這四種蘭花中，竹枝石斛的繁殖能力最強(qiáng)。在進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)的四種蘭科植物里，竹枝石斛的活力比較高。TTC 染色的成功與否及著色程度主要取決于溫度、pH、濃度、保存時(shí)間以及種子的采集日期。TTC 浸泡種子保存時(shí)的溫度一般在30～35℃，pH正常應(yīng)在6.5～7.5 之間，實(shí)驗(yàn)所用的TTC pH 為6；TTC 浸泡種子的時(shí)間因被染色體的不同而不同，而四種實(shí)驗(yàn)對(duì)象的種子浸泡時(shí)間均為24h；為了方便計(jì)算從采集種子到做實(shí)驗(yàn)之間相隔的時(shí)間，確保種子不會(huì)因?yàn)閮?chǔ)存時(shí)間過(guò)久而全部死亡，四種蘭花種子的采集日期在上文已有記錄，不過(guò)四種蘭花種子的采集時(shí)間距做實(shí)驗(yàn)的時(shí)間均較近，可以確保種子正常的存活率。從整體分析，蘭花種子在TTC 中浸泡的時(shí)間不夠，所以四種蘭花種子的染色程度也不一樣。

6 研究結(jié)論與建議

竹枝石斛適合大量培養(yǎng)并回歸自然以保護(hù)蘭科植物，先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)蘭花及蘭花種子萌發(fā)所需的真菌可以有效地促進(jìn)蘭科植物的繁殖，建議科研人員利用含有真菌的培養(yǎng)液大量培養(yǎng)竹枝石斛并回歸自然。